增生性瘢痕中TGF-β和胶原酶、TIMP-1mRNA表达的定量研究

1、    增生性瘢痕中TGF-和胶原酶、TIMP-1 mRNA 表达的定量研究        【摘要】目的观察TGF-和胶原酶、TIMP-1 mRNA在增生性瘢痕中的表达，探讨TGF- 对MMP-1和TIMP-1表达的影响以及它们在HTS形成中的作用。方法采用原位杂交和像分析技术，进行定性和定量分析。结果增生性瘢痕组织中TGF-和TIMP-1表达较正常皮肤明显增高，平 均积分光密度分别增加了8倍和7倍，也较胶原酶的表达明显增高，相差非常显著，TGF- 表达与

2、TIMP-1表达呈高度正相关。结论TGF-可能促进TIMP-1表达，抑制胶原酶活性，阻止胶原降解， 是HTS形成的重要原因。【关键词】瘢痕转化生长因子胶原酶金属蛋白酶组织抑制 因子 Quantitative study on the expression of mRNA for TGF- and collagenase (MMP-1),tissue metalloproteinase inhibitor-1(TIMP-1) in hypertro phic scarWU Jixiang?CHEN DeyingWU Zongyao（Department of Phys ical Medi cin

3、e and rehabilitation,Southwest Hospital, The Third Military Medical Unviersity,Chongqing 400038,PR China）【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of mRNA f or TGF-,MMP-1 and TIMP-1 and their effects on the formation of hypertrophic scar (HTS). MethodsIn situ hybridization and image analysis

4、w ere used in this study. ResultsThe expressions of mRNA for TGF- and TIMP-1 in HTS was greatly increased compared with those of normal skin. The average integral o ptical density of mRNA for TGF- and TIMP-1 increased by 8 and 7 folds (P <0.001) related to normal skin and the expression of them s

5、howed highly positive correlation.ConclusionsThe findings suggest that TGF- prom o tes the expression of TIMP-1 and may be a possible factor for hypertrophic scar formation.【Key words】Scar; Transforming growth factor- beta; Collagenase; Tissue metalloproteinase inhibitor-1增生性瘢痕(hypertrophic scar,HTS

6、)是创伤愈合过程中胶原合成与降解平衡失调，胶 原过度沉积的结果，其发病机理至今仍不清楚1。目前HTS中胶原合成的研究报 道很多，而胶原降解的研究极少2。胶原酶(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)是胶原降解的关键酶，在启动体内胶原降解中具有重要作用，其表达和活性受许多因素 的调控，如生长因子和金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase -1,TIMP-1)3。TGF-是重要的生长因子，已有研究表明在HTS组织中TGF- 基因表达和蛋白均明显增高，与HTS的形成密切相关4。为此我们应用原位杂交和 像分析等方法观

7、察了TGF-和MMP-1、TIMP-1在HTS组织中的表达，以探讨TGF-对MM P-1和TIMP-1表达的影响及它们在HTS形成中的作用。1材料与方法1.1标本HTS标本24例，其中男性16例，女性8例，年龄1044岁。标本均为烧伤后半年 至2年的增生性瘢痕(瘢痕呈粉红或紫红色，高出皮面，质较硬，在病理切片上表皮呈明显的 多形性，真皮中含大量呈涡轮状或结节状的胶原纤维)，取自整形手术。正常皮肤(normal s kin,NS)6例取自外科手术。取材后立即置入液氮保存。1.2主要材料MMP-1和TIMP-1质粒由日本Kanazawa大学S.Sato惠赠，MMP-1探针长度 分别为1.5KB和0

8、.6KB。TGF-质粒由美国Chicago大学Howard Hugher Medical Institut e的 GI.Bell惠赠，探针长度为1.8KB。地高辛配基标记检测试剂盒购自宝灵曼公司，EcoRI、Ba mHI、蛋白酶K、丙烯酰胺购自华美生物公司，I型胶原购自Sigma公司，其余试剂均为国产分 析纯。1.3方法1.3.1制备探针按常规将3种质粒转入大肠杆菌JM109并扩增，碱裂解法大量抽提质粒 ，透析袋电泳洗脱法制备质粒探针，按药盒说明书用地高辛随机引物法标记探针，标记探针 置-20备用。1.3.2原位杂交方法所有标本均做冰冻切片，片厚20um，用4%多聚甲醛固定30min，PBS漂

9、洗10min ×2，蛋白酶K ( 100 g/ml)37消化30min，PBS和2×SSC各漂洗10min，入杂交液45杂交24h。杂交后依 次 用4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC和PBS各漂洗10min，再进行地高辛碱性磷酸 酶显色反应。阳性杂交信号为蓝紫色。阴性对照(杂交液中不含探针)无色。1.3.3像半定量分析和统计处理采用CMIAS真彩色像分析系统(空军总医院生物医学工程研究所产品)，检测HTS和NS原位杂 交切片，在20倍放大下随机选取4个测定区域，按一定阈值分割阳性细胞，测定HTS和NS组织 中TGF-和

10、MMP-1、TIMP-1mRNA表达的平均积分光密度和面密度值，所得资料用t检 验和相关分析做统计处理。2结果2.1MMP-1、TIMP-1和TGF- mRNA的原位杂交在HTS组织中TGF- mRNA表达明显增强，强阳性颗粒成群分布于胶原结节中，由呈涡轮状 或结节状的胶原纤维排列而成，阳性细胞主要为成纤维细胞(1)，TIMP-1表达明显增加， 阳性颗粒主要见于胶原结节，阳性细胞多数为成纤维细胞(2)。MMP-1 mRNA在HTS中也有 表达，散在分布于真皮中(3)。NS中TGF-和TIMP-1 mRNA表达弱而少，偶见有少数表 达呈弱阳性的成纤维细胞散在分布于真皮(4，5)，而MMP-1 m

11、RNA表达阳性细胞主要为汗 腺上皮细胞(6)。阴性对照切片中未见阳性颗粒。1(上)HTS组织TGF-原 位杂交阳性颗粒分布于胶原结节(下)HTS组织TGF-杂交阳性的成纤维细胞2(上)HTS组织TIMP-1杂交阳性颗 粒主要见于胶原结节(下)TIMP-1阳性的成纤维细胞Fig 1(Up)Strong expression of mRNA for TGF- confined to the collagen nodules in HTS tissues (Down)HTS fibroblasts s howed strong TGF- expressionFig 2(Up)Strong expre

12、ssion of mRNA for TIMP-1 was observed in collagen nodules in HTS tissues (Down)The fibroblasts s howed TIMP-1 expression in HTS3HTS中MMP-1阳性颗粒散在分布于真布中Fig.3The positive particles of MMP-1 were seen in dermis of HTS4NS中MMP-1阳性颗粒散在分布于真布中Fig.3The positive particles of MMP-1 scattered in  dermis of N

13、S5NS中TIMP-1弱阳性颗粒少，散在分布于真皮中Fig.5Few of light positive particles of TIMP-1 were observed in NS6NS中MMP-1杂交阳性颗粒见于汗腺上皮细胞Fig.6The positive particles of MMP-1 were observed in epithelial cells of sweat gland2.2MMP-1、TIMP-1和TGF-表达的半定量分析HTS组织中MMP-1面密度和平均积分光密度(average integral optical density,AIOD)较NS 略有增加(P&

14、gt;0.05)。TIMP-1和TGF-面密度和AIOD较NS明显增高(P<0.01)。HT S中TGF-和TIMP面密度和AIOD明显高于MMP-1，TIMP-1表达和TGF-表达，并呈显著的 正相关(r=0.967,P<0.01)。结果见表1。表1HTS和NS组织MMP-1、TGF-与TIMP-1 表达的像分析结果Tab 1The results of quantitative analysi s of expressionof MMP-1、TGF- and TIMP-1 in HTS and NS tissues测定指标面密度AIODHTSNSHTSNSMMP-11.50&#

15、177;0.571.25±0.50151±3687±15TIMP9.40±0.92*1.30±0.951098±78*155±23TGF-9.75±0.35*1.67±0.091313±110*151±36与NS比较：P<0.01；与MMP-1比较：*P<0.01。 3讨论原位杂交方法可以对基因活化表达的mRNA进行原位定性、定位和定量分析。我们用特异性 TGF-和MMP-1、TIMP-1探针进行了HTS组织的原位杂交。结果表明三者在HTS组织中均有 表达，阳性颗粒主要分布

16、于胶原结节区，提示结节区是胶原代谢紊乱的主要区域，这与许多 组化及形态学的研究结果一致1。我们首次原位观察了HTS中MMP-1、TIMP-1的 表达，发现TIMP-1表达显著增高，AIOD是NS的7倍(P<0.01)，也明显高于MMP-1的表 达 ，提示TIMP-1的异常表达可能与HTS形成密切相关。许多研究认为TIMP按1：1与MMP-1形成 复合体，抑制酶的活性，在调控胶原降解中具有重要的作用3。Bullun5 报道慢性不愈合伤口组织液中TIMP-1含量明显降低，而在由射线诱导的皮肤纤维化病中T IMP-1表达显著增加，表明TIMP是影响胶原降解的重要因素6。TGF-是具有多种生物学

17、功能的蛋白多肽物质，在创伤愈合的所有阶段均发挥了重要的作 用7。Robert等8发现在创面基质中含有丰富的TGF-，它促进成纤 维细胞合成和分泌胶原等ECM分子，加速创面的愈合，但它的过度作用则可能诱导瘢痕的形 成。我们的研究结果显示TGF-在HTS组织中表达明显增强，AIOD是NS的12倍(P<0.01 )，也 显著高于HTS中MMP-1的表达(8倍，P<0.01)，提示TGF-的异常表达在HTS的形成中 具 有重要的作用。TGF-在HTS形成中的作用已有了一些研究，但多限于其对胶原表达和合成 的调控。有学者报道TGF-上调、型胶原基因的表达，促进胶原合成，是HTS胶原合成 异常

18、增加，胶原大量沉积的重要原因4。目前对TGF-影响HTS胶原降解的研究 较少2。Overall9在培养的皮肤成纤维细胞 中加入TGF-后发现胶原酶表达明显降低，而TIMP-1表达和活性增高。我们同时观察了 TGF-、MMP-1和TIMP-1在HTS中的表达，发现TGF-和TIMP-1表达较MMP-1表达明显 增高，相差非常显著；TGF-和TIMP-1表达呈高度正相关。结果提示TGF-促进TIMP-1 表达，抑制MMP-1活性，阻止胶原降解，可能是HTS形成的重要原因。作者单位：武继祥（重庆，第三军医大学西南医院康复理疗科400038）吴宗耀（重庆，第三军医大学西南医院康复理疗科400038）陈

19、德英（第三军医 大学组织胚胎教研室）参考文献1，Murray JC. Keloids and hypertrophic scar. Clin Dermatol,1994,12:27-3 7.2，Younai S,Nichter LS,Wellisz T, et al.Modulation of collagen synthesis by transforming growth factor- in keloid and hypertrophic scar fibroblasts. Ann Plast Surg,1994,33:148-154.3，Woessner JF. Matrix meta

20、lloproteinases and their inhibitors in connective tis sue remodeling. EASEB J,1991,5:2145-2154.4，Zhang K,Garner W,Cohen L,et al.Increased type and collagen and tran sforming growth factor-beta mRNA and protein in hypertrophic burn scar. J Inves t Dermatol,1995,104:750-758.5，Bullen EC,Longaker MT,Upd

21、ike DL.Tissue inhibitor of metalloproteinases-1 is decreased and activated gelatinases are increased in chronic wounds. J Invest De rmatol,1995,104:236-240.6，Lafuma C,Nabort RAE,Crechet F,et al.Expression of 72-KDa gelatinase(MMP-2),collagenase(MMP-1) and tissue metalloproteinase inhibitor (TIMP) in primar y pig skin fibroblast