大鼠局灶性脑缺血IL-8变化的研究

1、    大鼠局灶性脑缺血IL-8变化的研究        摘要：目的探讨IL-8在脑缺血损伤中的变化。方法采用改良Zea Longa线栓法大鼠MCAO模型，将大脑中动脉(MCA)闭塞不同的时间。应用双抗体夹心间接ELISA法检测缺血组和对照组大鼠受伤脑组织及血清中IL-8浓度。结果闭塞3h缺血侧半球湿重大于非缺血侧(P<0.05)，并维持至48h；缺血组脑组织IL-8含量在MCA闭塞3h处于较低水平，随后逐渐升高，至6h达高峰，随后又降低；血清中IL-8含量在缺血3h达

2、高峰，随后缓慢下降。空白组、假手术组脑组织内IL-8含量高于缺血组(P<0.01)，同一大脑非损伤侧高于损伤侧。结论IL-8具有双重作用，既参与脑组织的正常代谢及生理功能，又参与了脑缺血损伤的病理生理过程。关键词：大鼠；脑缺血；细胞因子IL-8中分类号：R743文献标识码：A文章编号：1003-2754(2000)04-0221-03 The change of the level of interleukin-8 in focal cerebral ischemia in ratsCAO Qiu-yunPAN Xu-dong（Department of Neurology,The Af

3、filiated Hospital,Qingdao University Medical College,Qingdao 266003）Abstract:ObjectiveTo study the change of the level of interleukin-8(IL-8) in cerebral ischemia injury. MethodsThe middle cerebral artery (MCA) was occluded for different time with modified Zea Longa，s MCAO model. The level of IL-8 i

4、n injured brain tissue and blood serum was detected with double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,both in ischemia group and in control group. ResultsThe weight of the injured brain hemisphere is heavier than that of uninjured hemisphere from 3 hours to 48 hours after cerebral isch

5、emia(P<0.05). The content of IL-8 in injured brain tissue was in lower level at 3 hours after ischemia,and then increased,peaked at 6 hours,and then decreased. The concentration of IL-8 in serum peaked at 3 hours after ischemia,and then decreased slowly. The content of IL-8 in brain tissue of con

6、trol group was higher than that in ischemia group (P<0.01). ConclusionIL-8 has double roles it play a role in metabolism and function in normal brain tissue and a role in pathophysiological course of cerebral ischemia injury.Key words:Rat;Cerebral ischemia;Cytokine;IL-8白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)

7、是一种炎性趋化因子，对中性粒细胞具有趋化和激活作用。脑缺血损伤可产生完整的炎性反应，诱导细胞因子的表达。目前，细胞因子在脑缺血损伤中的作用已有不少报道，而IL-8在脑缺血损伤中的作用报道不多。作者就IL-8在脑缺血损伤中的作用进行了探讨。1材料与方法1.1实验动物及分组健康成年Wistar大鼠，清洁级，共56只，体重250±30g，雌雄不限，由青岛市实验动物中心提供。随机分为：(1)空白组(n=8);(2)假手术对照组(n=8)；(3)缺血组：MCA分别闭塞3、6、12、24、48h，每个时间点8只。1.2栓线制备取4-0单股尼龙线50mm,直径0.2mm，将头端0.5mm加热成光滑

8、球形，在光镜下呈光滑圆球，于线端18.5mm处作标记，75%酒精清洁后置肝素化生理盐水中备用。1.3动物模型制备将大鼠以3.6%水合氯醛(360mg/kg体重)腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台上，取颈部正中切口，钝性分离甲状腺，将其上翻并加以保护，分离右侧颈总动脉(common carotid artery,CCA)、颈外动脉(external carotid artery,ECA)和颈内动脉(internal carotid artery,ICA)，结扎ECA和CCA近心端，于CCA远心端备线，于ICA置一动脉夹，参照改良Zea Longa方法1，2，于CCA近分叉处剪一约0.2mm的“V”字

9、形切口，插入栓线，插入深度18.5mm±0.5mm，使栓线进入ICA，越过MCA开口处，到达大脑前动脉(anterior cerebral artery,ACA)起始部，阻断MCA的所有血液来源，扎紧备线，甲状腺复位，关闭并缝合皮肤切口，栓线外留约1cm。缺血组大鼠将大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)分别闭塞3、6、12、24、48h。假手术组手术过程同前，将栓线插入1min拔出。术中室温保持在25，术后大鼠保温。1.4检测指标及方法1.4.1标本收集每只模型成功的大鼠在规定的时间点过度麻醉，开胸暴露心脏、自右心房取血2ml，37.4孵育3小时，然后2

10、000r/min离心，分离血清，封存，置 -20 冰箱待测； 同时， 依次用 0.85%生理盐水及4%多聚甲醛各200ml作心脏灌注，固定。断头取脑，用电子秤称脑重量，分开两半球，分别称重，距额极2.5mm处向后切取2.5mm脑组织，称重，按0.1g1ml的比例加4%多聚甲醛作脑组织匀浆，2000r/min离心，取上清，封存，置-20冰箱待测。1.4.2IL-8的测定IL-8的测定采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)，ELISA药盒购自美国Genzyme公司特许分装的深圳晶美生物工程有限公司，由专人严重按药盒说明书进行操

11、作。1.5统计学方法应用PEMS 2.1软件包行方差分析，q检验，t检验。2结果2.1脑缺血损伤后左右大脑半球重量比较，见表1。表1脑缺血左右大脑半球重量比较(±s,g)左半球右半球空白组假手术组缺血3h缺血6h缺血12h缺血24h缺血48h0.82±0.070.85±0.110.78±0.100.86±0.050.82±0.090.85±0.070.80±0.070.85±0.050.79±0.070.87±0.08*0.91±0.09*0.89±0.10*0.9

12、2±0.07*0.89±0.09*与左侧大脑半球重量比较(采用配对t检验)，*P<0.05,*P<0.01 2.2脑缺血损伤后受损脑组织及血清IL-8含量变化，见表2。表2脑缺血后受损脑组织和血清IL-8含量变化(±s)脑组织(pg/g)血清(pg/ml)空白组假手术组缺血3h缺血6h缺血12h缺血24h缺血48h10.41±1.8312.83±3.214.58±1.37*6.19±1.25*5.78±1.80*5.72±1.47*4.13±0.74*1.56±0.371.

13、84±0.483.61±0.81*2.67±0.22*2.69±0.39*2.68±0.71*2.33±0.70*各实验组与空白对照组比较*P<0.01 3讨论3.1脑缺血后受损脑组织和血清中IL-8含量的改变呈时间依赖性。Liu等研究发现3，大鼠MCAO后6h，在缺血皮层可见CINC(cytokine-induced neutrophil chemoattractant,相当于IL-8)mRNA升高，12h达高峰，24h后降低。原位杂交发现4，大鼠持续MCAO后15min有IL-1 mRNA的明显表达，3h达高峰，4d内逐渐消

14、失，1h出现TNF-mRNA的表达，612h达高峰，12d内逐渐降低。IL-1和TNF-均为诱导产生IL-8的细胞因子5。本实验发现MCAO后，MCA供血区脑组织IL-8含量，在3h处于较低水平，随后逐渐上升，6h达高峰，然后缓慢下降。其产生晚于IL-1和TNF-。说明脑缺血后，能量的缺乏，兴奋性氨基酸的释放，致使钙内流、细胞内钙库释放，激活大量的酶，使氧自由基的产生增加，进一步激活炎性细胞因子和IL-1和TNF-和TGF-等。IL-1和TNF等进一步诱导IL-8的产生使IL-8的水平增加。而TGF-可抑制星形胶质细胞产生TNF-6，另外，尚有内源性控制系统产生的细胞因子抑制，导致IL-8的水

15、平再度降低。3.2脑缺血时，脑细胞的无氧呼吸数分钟，即由于储备能量的耗竭而诱发酸中毒和能量型离子泵功能丧失。Na+-K+ATP酶的转运障碍引起细胞肿胀和细胞毒性水肿。本实验发现缺血3h，大脑半球重量损伤侧开始大于非损伤侧，大脑右半球重量开始大于左半球(P<0.05)，6h时明显，持续到24h、48h后水肿程度减轻，仍重于左半球(P<0.05)，与脑组织IL-8含量变化时相基本一致。3.3IL-8被发现以来，一直以炎症趋化因子的身份存在。很多作者认为趋化细胞因子在正常细胞中不表达，通过研究认为脑胶质细胞可以表达CINC，在缺血6h出现过度表达，12h时达高峰。本实验经过反复实验，并设

16、空白对照组、假手术对照组及自身对照，发现空白组、假手术组脑组织内IL-8含量高于脑缺血组(P<0.01)，脑缺血组非损伤侧脑组织IL-8含量高于损伤侧(P<0.05)。说明正常脑组织可以合成并释放一定数量的IL-8。笔者认为，正常脑组织IL-8含量高于受损脑组织，以及脑组织和血清中IL-8水平在脑缺血损伤中上升及下降的时相不一致表明，IL-8的产生及作用存在差异：其一为脑源性IL-8，参与正常脑组织的代谢和功能；其二为外周性IL-8，主要由内皮细胞、中性粒细胞、单核细胞等产生，参与炎症反应过程。以上结果可能是，正常脑组织产生一定量的IL-8，在缺血损伤的情况下，脑源性的IL-8产生

17、受到抑制，使受损区脑组织的IL-8含量骤然下降。随后由缺血损伤导致炎症反应，产生炎症细胞因子，如IL-1、TNF- Et-17等，这些细胞因子诱导内皮细胞、单核细胞和中性粒细胞等产生IL-8，主要起炎症趋化作用，吸引中性粒细胞到达损伤区，加重该区域的损伤。随着炎症的发展，调动自身控制系统及细胞因子的抑制，致使炎症反应所产生的IL-8逐渐降低。总之，IL-8可能存在双重作用，正常脑组织可以产生起生理作用的IL-8。脑缺血损伤后，炎症反应时可产生起炎性趋化作用的IL-8。所以，如果在适当的时间给予对抗IL-8的药物，抑制参与脑缺血损伤的IL-8，预计可以改善脑缺血损伤的预后。作者单位：曹秋云（青岛

18、大学医学院附属医院神经科，山东 青岛 266003）潘旭东（青岛大学医学院附属医院神经科，山东 青岛 266003）参考文献：1Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in ratsJ. Stroke,1989,20:84-91.2王春霞，刘春风，包士尧. 大鼠局灶脑缺血再灌注模型改良后的实验研究J. 苏州医学院学报，1999，19：124-125.3Liu T,Young RP,Mc Donnell PC,et al. Cytokine-induced neurophil chemoattractant mRNA expressed in cerebral ischemiaJ. Neurosci Lett,1993,164:125-128.4Buttini M,Sauter A,Boddeke HW. Induction of interleukin-1 beta mRNA after focal cerebral ischemia in the ratJ. Brain Res M