人doppel蛋白及其类似蛋白PrPΔ32-121对SH-SY5Y细胞的细胞毒性作用

1、人doppel蛋白及其类似蛋白PrP32-121对SH-SY5Y细胞的细胞毒性作用         11-01-06 16:18:00     编辑：studa20             作者：徐琨，王新，田婵，石崧，王桂荣 石琦，周瑞敏，姜惠英，楚雍烈，董小平【摘要】  目的 体外观察细胞瞬时表达的人Dpl(doppel)蛋白对人神经

2、母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用，并与其结构类似蛋白截短型PrP(PrP32-121)加以比较。方法 通过PCR方法获得人PRND基因及截短型PRNP基因并克隆至真核表达载体，瞬时转染SH-SY5Y细胞后，观察蛋白表达及其定位情况；采用MTT实验检测转染细胞的生长状态；用流式细胞仪、Western blot等方法检测转染细胞的凋亡状态。结果 两种蛋白均可在转染细胞中表达，并存在于细胞膜上；MTT结果显示，在转染24h后均出现明显的细胞毒性作用；细胞凋亡相关实验发现，转染细胞Annexin V/PI双染阳性细胞数量增多，pro-casepase-3和Bcl-2因子水平降低。结论 瞬时表达的Dpl

3、蛋白与截短型PrP可产生类似的神经细胞毒性作用，并诱导启动细胞凋亡过程。 【关键词】  doppel蛋白；朊蛋白；细胞毒性作用；细胞凋亡              ChinaABSTRACT: Objective  To observe the biological activities of human doppel (Dpl) protein transiently expressed and Dpl-like protein PrP32-1

4、21 on a human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Methods  Recombinant mammalian expression plasmids containing human PRND gene and truncated PrP32-121 fragment were generated by PCR. The expression and location of Dpl and PrP32-121 post-transfection were observed by IFA. The cytotoxicity was meas

5、ured by MTT analysis. Cellular apoptosis was investigated by flow cytometry and Western blot. Results  Both Dpl and PrP32-121 protein were expressed and mainly located on the cell membrane. Remarkable cytotoxicity was detected on SH-SY5Y cells after 24 h transfection. Meanwhile, more Annexin V/

6、PI positively-stained cells as well as lower levels of cellular pro-caspase-3 and Bel-2 were detected in the cells receiving Dpl and PrP32-121 expressing plasmids. Conclusion  Dpl protein transiently expressed and PrP32-121 can lead to the similar neural cytotoxicity, probably triggering the ce

7、ll apoptosis program.KEY WORDS: doppel protein; PrP; cytotoxicity; apoptosis    朊病毒病(prion disease)是一类累及人类及多种动物中枢神经系统的致死性退行性疾病，潜伏期长，致死率高达100%，包括人类的克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、牛的疯牛病(bovine spongiform encephalopathy, BSE)等1。其致病因子目前认为是由细胞内正常朊蛋白PrP(或称PrPC)经空间构象转变后形成的异常折叠朊蛋白PrPSc所

8、致2-4，但对PrPC正常功能及PrPSc致病机制的研究仍不甚明了。近年来随着PRND基因的确立5，发现其编码一种朊蛋白样的膜蛋白，称作doppel(Dpl)蛋白，它和PrPC序列高度同源，两者的C末端具有25%同源性，但正常情况下在睾丸和心脏中高表达，而在脑中几乎不表达5-6。为了研究Dpl的生物学功能及其在朊病毒病发病机制中的作用，本实验在前期工作的基础上7，构建了人源Dpl及其结构类似蛋白N端截短型PrP(PrP32-121)真核表达质粒，在体外瞬时表达后，探讨Dpl蛋白和PrP32-121蛋白对SH-SY5Y细胞的影响。1  材料与方法1.1  主要试剂 

9、质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司；细胞培养液DMEM购自美国Gibco公司；LipotectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；PrP特异性单克隆抗体3F4购自丹麦Deko公司；6G3、-actin和Bcl-2单克隆抗体及Dpl、Bax和casepase-3多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；ECL Kit购自美国Perkin-Elmer公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma公司；Annexin V/PI双染试剂盒购自上海宝赛生物公司。1.2  真核表达质粒的构建 人全长PrP基因表达质粒pcDNA3.1-huPr

10、P1-253及全长Dpl基因表达质粒pcDNA3.1-huDpl1-176由本室保存。pcDNA3.1-huPrP32-121的PCR扩增：根据人PRNP基因序列设计引物，上游引入BamH，下游引入EcoR酶切位点(上游5-GCGGATCCATGGCGAACCTTGGCTGCTG GATG-3，下游5-GCGAATTCTCAT-CCCACTATCAGGAAGATGA-3)；另外一对中间引物(上游5-CAGCATGTAGCCGCCAAGGCCCCCGTTCCATCCTCCAGGCTTCGGGCG-3，下游5-CGCCCGAAGCCTGGAGGATGGAACGGG-GGCCTTGGCGGCTACA

11、TGCTG-3)。PCR反应条件：94 30s，63 30s，72 30s，共30个循环。PCR产物回收后与载体pMD18-T连接，经酶切后回收产物连接至pcDNA3.1(zeo+)真核表达载体，酶切及测序鉴定序列正确。1.3  细胞培养及转染 SH-SY5Y细胞培养液为含4.5g/L谷氨酸和100mL/L胎牛血清的DMEM。细胞用6孔板/96孔板培养至对数期生长期，每孔转染的总DNA量分别为2g/0.2g，转染使用LipofectamineTM2000转染试剂盒。1.4  Western blot 瞬时转染SH-SY5Y细胞24、48h后收获6孔板细胞

12、，刮下的细胞用PBS洗涤2次，5000r/min离心5min；在细胞裂解缓冲液(5mL/L Triton X-100，5g/L去氧胆酸钠等)中4孵育30min。样品煮沸10min后进行150g/L SDS-PAGE并转移至硝酸纤维素膜上，一抗用含有50g/L脱脂奶粉的PBST(1600)稀释，4过夜；二抗用同上的PBST(14000)稀释，最后用ECL显色试剂盒显色。1.5  间接免疫荧光(IFA) 转染后24h的细胞爬片用40g/L多聚甲醛溶液固定，室温15min，2mL/L Triton-X100通透5min，含100mL/L胎牛血清的PBST封闭45min，加一抗37孵育2h，二抗(FITC标记)室温孵育1h，复染后显微镜下观察。1.6  MTT检测 瞬时转染24、48h的96孔板细胞，每孔加入5mg/mL的MTT 20L，继续培养4h，吸去培养液；加入200L DMSO，摇床震荡10min，使结晶物充分溶解；450nm处用酶标仪测吸光度(A)值。实验重复3次，取其平均值。细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。1.7  流式细胞仪检测 瞬时转染24/48h的6孔板细胞，胰酶消化后用PBST洗涤2次，加入Annexin V和PI染料室温避光孵育15min，流式细胞仪上机检测。具体参见上海