兔缺血心肌中移植自体骨髓基质干细胞的治疗作用(1)

1、    兔缺血心肌中移植自体骨髓基质干细胞的治疗作用(1)    】 目的：验证骨髓基质干细胞（MSC）移植到缺血心肌中后是否在心肌的微环境中可以向心肌细胞分化，提高心功能. 方法：采用自体MSC体外培养扩增移植. 在通过结扎冠状动脉造成急性心肌缺血后，被5溴2脱氧尿苷（BrdU）标记后的MSC移植到自体的缺血心肌中. 结果：移植4 wk后，MSC向肌细胞分化，表达出横纹肌肌动蛋白（sarcomeric actin）和存在于闰盘中的connexin 43，移植后心肌表达VEGF增加(684±86) fg/

2、L vs (515±51） fg/L，P<0.05，缺血心肌局部血管密度增加(22.9±6.6)/HP vs (19.0±5.9)/HP，P<0.05，左室收缩功能明显强于对照组LVSP: （15.08±0.84）kPa vs （13.26±0.68） kPa; LVEDP: （1.53±0.28）kPa vs（ 19.03±0.41） kPa; dp/dtmax: （ 615.77±48.69）kPa/s vs （ 435.75±58.25）kPa/s; -dp/dtmax: （-401.1

3、7±46.23） kPa/s vs （-338.25±50.72） kPa/s, P<0.05. 结论：MSC移植可治疗心肌缺血，并且没有免疫排斥反应.【关键词】 骨髓基质干细胞；缺血心肌；移植0引言在离体实验中发现骨髓基质干细胞（marrow stromal cells，MSC）可以被5杂氮胞苷诱导为心肌细胞1. 由于自体MSC容易被获取，而且具有较强的增殖能力，自体MSC应用于临床可以不再需胚胎组织和应用免疫抑制剂，因此较其他来源的供体细胞更有优势. 为了同未来的临床实践相吻合，我们应用自体MSC移植入缺血心肌中，而没有用被诱导后的MSC. 目的是着重探讨移植后M

4、SC特异性蛋白的变化及其对与心功能的影响.1材料和方法1.1材料取健康雄性的新西兰兔(2.53.5) kg（浙江大学医学院动物实验中心），经耳缘iv戊巴比妥纳（30 mg/kg）麻醉，用骨髓穿刺针无菌抽取骨髓，Percoll细胞分离液分离细胞，接种于培养瓶中，培养液用含200 mL/L胎牛血清的完全LDMEM（2 mmol/L L谷氨酰胺，1×104 U/L青霉素和25 g/L两性霉素），37，50 mL/L CO2孵箱静置培养. 抽取的每个动物的骨髓基质干细胞及每个动物均进行编号. 取传第2代的MSC于移植前24 h用BrdU(5溴2脱氧尿苷, Sigma)标记骨髓基质干细胞，10

5、 L BrdU贮液(BrdU, 50 mg; 二甲基亚砜0.8 mL; 三蒸水1.2 mL)加入5 mL完全培养液中. 移植前用PBS调整细胞密度为1×1011/L. 标记细胞的检测（免疫组化）：先加2 mol/L盐酸（室温，50 min），正常山羊血清封闭10 min，不洗，甩掉，加含3 g/L Triton X100的140鼠抗Brdu mAb（抗体稀释液稀释），加入生物素标记的羊抗鼠抗体（室温80 min），加入SABC复合物室温50 min，DAB显色，脱水、透明、封片.1.2方法30 g/L的戊巴比妥钠（30 mg/kg）经耳缘iv麻醉. 心电图导联线与兔四肢相连接入八道生

6、理记录仪之心电图放大器（AC601G）记录标准导联心电图. 在胸骨左缘胸肋关节处剪断，肋骨开胸，剪开心包膜，用小拉钩将心包膜固定于胸壁，充分暴露心脏. 用眼科小圆针在冠状动脉左室支主干中上1/3处结扎，心电图导联上出现ST段弓背样抬高为结扎成功. 生存的13动物被随机分为2组，实验组（M组，n1=7）于心肌梗死前后缘上、中、下各3点分别注射自体MSC 1×1011/L，对照组（C组，n2=6）注射同等数量的PBS. 4 wk后重返实验室，麻醉方法同前. 先行心脏彩超检查，测量左室后壁运动幅度、左室收缩期室壁增厚率及射血分数，而后分离颈动脉行左心室插管，左心室插管经三通接八道生理记录仪

7、之载波放大器，记录左心室压力曲线，左心室压力微分曲线，记录左心室舒张末压（LVEDP）、左心室收缩压（LVSP）左心室压力微分（dp/dt）： 曲线及左室压正负变化最大速率（±dp/dtmax）.1.2.1移植MSC向心肌细胞分化的检测测量完毕后，取心肌梗死区的组织进行冰冻切片，行免疫荧光双标法染色确定移植骨髓基质干细胞向心肌细胞分化. 免疫荧光双标法：切片加2 mol/L HCl中30 min（37）， 0.01 mol/L硼酸液中和10 min，浸入含0.3 g/L Triton X100的0.01 mol/L KPBS 30 min后，首先入1100小鼠抗兔sarcomeric

8、 actin抗体4孵育24 h后，0.01 mol/L KPBS漂洗，然后入1100的FITC标记的antiBrdU抗体及1100的Cy3标记的羊抗小鼠IgG (1200的TRITC标记的羊抗小鼠IgG)，避光孵育4 h，漂洗后缓冲甘油封片，激光共聚焦显微镜观察.1.2.2Western blot分析取心肌梗死区的组织，在-80和37之间反复冻融6次，移入1.5 mL Ep管中，4，14 800 g离心15 min，取上清. 用100 g/L的SDSPAGE胶分离蛋白质，Bradford法蛋白定量后，均取20 g总蛋白行120 g/L SDSPAGE凝胶电泳，电转移于NC膜上，加入一抗VEGF

9、 (11000, Chemicon), bFGF (11000, Santa Cruz)，4过夜. PBST洗膜15 min×1. 将膜装入塑料袋中，加入用PBST稀释羊抗小鼠IgG（11000）， 37 1 h. PBST洗膜15 min×3. 放射自显影：按照ECL试剂盒(Amersham公司)说明进行，观察照相.            【关键词】缺血心肌Autologous marrow stromal cell transplantation fo

10、r improving rabbit cardiac performa         本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。1.2.3ELISA法测定局部心肌组织中VEGF的表达将局部心肌组织匀浆后以24 800 g离心.用ELISA试剂盒(Santa Cruz)检测心肌组织中VEGF的表达.1.2.4梗死区血管数目的检测切片经过免疫组化染色血管标志物凝血因子. 采用

11、SABC免疫组化法染色（武汉博士德），组织切片加入小鼠抗因子mAb (Dako)在4过夜，加入生物素标记的羊抗小鼠IgG 37孵育1 h，再滴加SABC，37孵育1 h，最后用DAB显色，苏木素复染. 经过免疫组化染色的微血管呈棕黄色，为了量化缺血区的血管数量，每只动物取10张切片，每张切片随机取3个200×视野，进行血管记数. 凡是免疫组化凝血因子染色成棕黄的2个或2个以上内皮细胞簇均作为1个血管记数.统计学处理：所有资料用x±s表示，由SPSS 10.0软件包处理. 两组间比较采用t检验，不同时间点超声观察指标的比较采用重复测量资料的方差分析，P<0.05为有统计

12、学意义.    2结果在原代培养的MSC中，多数为成纤维样的梭形细胞，偶有宽阔、平坦的多边形细胞，初始细胞呈团簇生长，向四周发散. 经换液培养后，造血细胞基本消失，贴壁细胞体积较大，均为一致的梭形细胞. 随着时间的延长，细胞形成克隆样生长，渐渐铺满整个培养瓶. 传代后生长的细胞形态一致，均为成纤维样的梭形细胞，有时可见细胞融合（图1A）. 我们用BrdU标记准备移植的MSC. BrdU在细胞生长的S期标记细胞核，可见BrdU阳性的细胞核呈现棕黄色，还可见到核分裂像（图1B）. 移植的MSC经过免疫荧光双标法显示BrdU及sarcomeric actin(

13、connexin 43)通过Western blot检测分析显示移植MSC的心肌组织中VEGF和bFGF表达较对照组高（图4），ELISA分析显示移植MSC可促进心肌组织中VEGF表达(684±86) fg/L vs (515±51) fg/L，P<0.05. 凝血因子存在于血管壁，介导凝血反应，是血管内皮细胞的标记物，通过免疫组化可显示微血管内皮细胞呈现棕黄色（图5）. 实验组血管数量明显高于对照组(22.9±6.6)/HP vs (19.0±5.9)/HP，P<0.05.从超声心动图上显示左室侧壁运动幅度（LVFWSD，mm）、左室收缩期

14、室壁增厚率(LVT，%)及左室射血分数(LVEF，%)在术前和移植前均没有明显差异. 移植后4 wk后，实验组（M组）和对照组（C组）有明显差异. 左室侧壁运动幅度:（1.75±0.42）mm vs （1.09±0.28）mm; 左室收缩期室壁增厚率: （18.5±4.8）% vs （10.8±3.6）%; 3讨论兔可提供充足数量的MSC以供移植所需2. 心肌中的微环境可以支持被移植的MSC的生长，并且可以促进MSC向心肌细胞分化3-4. 我们发现被BrdU标记的MSC移植到心梗区后表达出横纹肌肌动蛋白，同时表达出存在于闰盘中的connexin 43，说

15、明分化为心肌细胞的MSC同周围心肌细胞通过闰盘连接，同周围宿主细胞形成功能合胞体. MSC的这种“归巢”和表达不同组织特异性基因的能力说明组织微环境对于MSC 的分化起了重作用. 我们发现，移植MSC后衡量左室收缩功能的指标(LVEF, LVSP，dp/dtmax，左室后壁运动幅度和左室收缩期室壁增厚率)较对照组高，左室舒张功能指标（LVEDP和dp/dtmin）较对照组恢复好. 移植MSC后，心肌缺血组织表达bFGF和VEGF增加，而且血管数目较对照组增多. 这种不同于以前报道的同种基因大鼠之间进行的细胞移植模型5，更接近于临床，意义更大.【参考文献】1 Hakuno D, Fukuda K

16、, Makino S, et al. Bone marrowderived regenerated cardiomyocytes(CMG Cells) express function adrenergic and muscarinic receptorsJ. Circulation, 2002,105(3):380-386.2 Abbott JD, Giordano FJ. Stem cells and cardiovascular diseaseJ. J Nucl Cardiol, 2003,10(4):403-412.3 张勇，蔡振杰，陈如坤. 小鼠骨髓基质干细胞定向诱导为前体心肌细胞J. 第四军医大学学报，2004,25(17)：1570-1574.4 吴铁军，蔡振杰，俞世强，等. 不同浓度5杂氮胞苷对骨髓间质干细胞体外诱导分化的