反义阻断CROC-1基因表达导致细胞生长变慢

1、    反义阻断CROC-1基因表达导致细胞生长变慢        摘要目的：建立CROC-1基因表达被阻断的FL-CROC-1-细胞系，研究CROC-1基因在细胞生长中的作用。方法： 运用反义技术将新近发现的人泛素缀合酶样蛋白基因CROC-1的适当长度cDNA片断克隆到本室改建的真核细胞表达载体pMAMneo-amp-中，经限制性内切酶谱分析筛选出反向插入的表达CROC-1反义RNA的重组质粒。将此反义表达重组质粒(pMAM-antiCROC-1)用改良的磷酸钙法转染人羊膜

2、FL细胞并用含G418的培养基筛选，测定G418抗性的FL-CROC-1- 细胞系的生长速度。结果：建立的FL-CROC-1- 细胞系在地塞米松诱导下CROC-1基因表达被反义抑制后，其生长速度较对照FL细胞及转染了载体pMAMneo-amp- 的FL细胞(FL-MAMneo)的明显要慢(P0.05)。结论：本研究成功地建立了CROC-1基因表达被阻断的FL-CROC-1- 细胞系，并提示CROC-1基因编码的泛素缀合酶样蛋白在细胞生长中起正调控作用。主题词 RNA， 反义；遍在蛋白；基因表达调控中分类号Q344.13文献标识码A文章编号1000-4718(2000)07-0577-04 Th

3、e antisense block of CROC-1 gene expression makes cells grow slowerCHEN Jian-ming, YU Ying-nian, CHEN Xing-ruo(Department of Pathophysiology, Medical School of Zhejiang University, Hangzhou 310031， China)Abstract AIM：To establish FL-CROC-1- cell line in which CROC-1 gene expression was blocked and s

4、tudy the role of CROC-1 gene in cell growth. METHODS：The appropriate length cDNA fragment of the recently identified human gene CROC-1 which encodes ubiquitin-conjugating enzyme like protein(Ubc-like protein) was cloned into the reconstructed eukaryotic expression vector pMAMneo-amp- by antisense st

5、rategy. The recombinant plasmid which can express CROC-1 antisense RNA was selected by restriction enzyme map analysis. The antisense expression recombinant plasmid pMAM-antiCROC-1 was then transfected into human amnion FL cells by a modified calcium phosphate-mediated transfection procedure and sel

6、ected with MEM medium containing 400 g/mL geneticin. Finally ,the growth rate of the G418 resistant FL-CROC-1- cell line was determined. RESULTS：When the antisense inhibition of CROC-1 gene expression was induced by dexamethasone, the growth rate of the FL-CROC-1- cell line was obviously slower as c

7、ompared with that of the control FL cell and FL-MAMneo cell which was established by transfection of plasmid pMAMneo-amp- (P0.05). CONCLUSIONS：FL-CROC-1- cell line was successfully established in this study and the result of FL-CROC-1- cell growth suppression suggests that CROC-1 gene encoded Ubc-li

8、ke protein plays a positive regulation role in cell growth.MeSH RNA, antisense； Ubiquitin;Gene expression regulation泛素(ubiquitin)存在于所有真核细胞中，是一种高度保守的76个氨基酸残基的蛋白。细胞蛋白的泛素化修饰起靶向信号(targeting signals)的作用，可使底物蛋白发生26S蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白水解，蛋白的这种及时的选择性降解在细胞的许多代谢过程中起关键作用1。泛素需经过E1-E2-E3酶促级联反应才能缀合到底物蛋白，在缀合途径中，泛素缀合酶(u

9、biquitin-conjugating enzyme,Ubc, E2)起关键作用1。真核细胞内最近还发现了一类泛素缀合酶样蛋白(Ubc-like protein)，又名Uev(ubiquitin-conjugating E2 enzyme variant)蛋白，它们在序列及二、三级结构上类似于泛素缀合酶，但缺乏泛素缀合酶催化活性所必需的关键性半胱氨酸残基，因此，泛素缀合酶样蛋白不具备泛素缀合活性2。人体细胞内目前已发现有3种Uev，即Uev-1/Croc-1、Uev-2/hMms2及Tsg101，酵母细胞中只发现1种，即Mms2。泛素缀合酶样蛋白可能是蛋白泛素化的新的调节因子，在体内以E2酶

10、显性负变异体的形式起作用2。遗传分析发现酵母Mms2蛋白参与其细胞内的无误性复制后修复(error-free postreplication repair，error-free PRR)通路。泛素缀合酶样蛋白可能起增加泛素缀合的底物蛋白多样性及选择性作用3。本文运用反义技术建立CROC-1基因表达被阻断的FL-CROC-1- 细胞系并对其生长速度进行测定。材料和方法一、CROC-1反义RNA表达重组质粒的构建重组有Croc-1B全长cDNA序列的重组质粒pBluescript-C1B-pBS-C1B)由加拿大Saskatchewan大学的W. Xiao博士赠送。经ACC (TaKaRa)酶切，

11、切出的840 bp长片断包含Croc-1B蛋白整个开放阅读框(open reading frame)，用Klenow片断(Promega)将此840 bp片断两端填平，再用T4 DNA 连接酶(TaKaRa)在片断两端连上Sal 连接子(上海生工)，而后经Sal (TaKaRa)酶切使其两端生成Sal 粘性末端，再将其克隆到本室改建的真核细胞地塞米松诱导表达载体pMAMneo-amp-4多克隆位点的Sal切点上，最后经Nhe (TaKaRa)酶切(在载体多克隆位点的目的片段插入的Sal 位点上游及插入片断的内部第622位碱基处分别有一Nhe 切点)并对酶切谱进行分析，反向插入的重组子经Nhe酶

12、切后应该出现228 bp及9 kb二条带。二、细胞转染及筛选人羊膜FL细胞由本室提供，贴壁生长于含10%小牛血清(GIBCO BRL)及青、链霉素的MEM(GIBCO BRL)培养液中。用改良的磷酸钙法5将构建好的表达CROC-1反义RNA的真核细胞表达重组质粒2030 g转染培养的FL细胞，在37、5%CO2条件下用含G418(400 g/mL)的MEM全培养液进行筛选培养，每隔23 d换1次液。同时用空载体pMAMneo-amp-转染FL细胞，以建立FL-MAMneo细胞系作为载体对照。三、细胞生长曲线测定将FL、FL-MAMneo及FL-CROC-1- 细胞分别以3×104 c

13、ells/mL种于24孔培养板，每种细胞6组，每组4个复孔，用含G418(G418工作浓度为200 g/mL, 适用于FL-MAMneo及FL-CROC-1- 细胞)或不含G418(适用于FL细胞)的MEM全培养液(含地塞米松，工作浓度为10-5 mol/L，用于诱导重组质粒pMAM-antiCROC-1表达CROC-1反义RNA)于37、5%CO2条件下培养24 h，从第2 d开始每天计数，共计6 d。结果一、CROC-1反义RNA表达重组质粒pMAM-antiCROC-1的建立从pBS-C1B上切出的840 bp长Croc-1B cDNA片断，重组到pMAMneo-amp-多克隆位点的Sa

14、l 切点上后得到的重组质粒，经Nhe 酶切，酶切产物琼脂糖胶电泳后发现，其中的一个重组质粒出现228 bp及9 kb二条带，说明该重组质粒就是反向插入的表达CROC-1反义RNA的表达重组质粒pMAM-antiCROC-1(见1、2)。     Fig 1Physical map of theCROC-1 antisense RNA expression recombinant plasmid pMAM-anti CROC-1The 840 bp length CROC-1 cDNA fagment was inserted into the Sal s

15、ite of the plasmid pMAMneo-amp- in antisense orientation1CROC-1反义RNA重组表达质粒pMAM-antiCROC-1的物理谱<"t57802 (2177 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309191422185" 261 163>Fig 21% agarose gel electrophoretic analysis of the recombinant plasmid digested with restriction endonucleas

16、esLane 1: GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder(MBI); lane 2: recombinant plasmid digested with Nhe (show 9 kb and 228 bp fragments); lane 3: recombinant plasmid digested with Sal(show 840 bp fragment); lane 4: parental plasmid pMAMneo-amp- digested with Sal; lane 5: DNA /Hind III Marker(MBI)2重组质粒经限制性内切酶消化后

17、1%琼脂糖凝胶电泳分析二、FL-CROC-1- 细胞系的建立pMAM-antiCROC-1、pMAMneo-amp-分别转染的FL细胞，经G418筛选培养，3周后分别得到10多个抗G418的细胞集落，而后换以维持性培养液(G418 200 g/mL)继续培养并扩大成FL-CROC-1-、FL-MAMneo细胞系，冻存备用。三、细胞生长曲线测定结果     Fig 3 The growth curve of FL celll, FL-MAMneo cell and FL-CROC-1- cellFrom the fourth day on , the gr

18、owth rate of FL-CROC-1- cell was obviously slower than that of the control FL cell and FL-MAMneo cell(P0.05).Results are the average cell number from tetramerous samples that are counted3FL、FL-MAMneo及FL-CROC-1- 细胞的生长曲线细胞计数结果发现，头3 d内CROC-1基因表达被阻断的FL-CROC-1- 细胞系的生长速度与对照FL及FL-MAMneo细胞的生长速度无明显差异，从第4 d开始

19、，FL-CROC-1- 细胞系的生长速度较对照FL及FL-MAMneo细胞的明显要慢，统计分析结果差异明显(P0.05)(见3)。讨论CROC-1基因最初是因其编码产物能转录激活人c-fos原癌基因启动子而被克隆分离6。人CROC-1/UEV-1基因位于染色体20q 13.2，CROC-1基因通过替换剪接至少可以编码4种不同的变体，即Croc-1A、Croc-1B、Mac4及Cra6，这4种变体羧基末端90个氨基酸残基相同，但氨基末端各不相同，氨基末端的差异性可能与蛋白-蛋白的特异性相互作用有关。Croc-1A和Croc-1B分别为170、221氨基酸残基的蛋白质，两者羧基末端的140个氨基酸

20、残基相一致。人各种类型细胞中至少能表达这4种变体中的1种7。Croc-1蛋白虽然在序列和结构上与E2酶相似，但因其在类似于E2酶催化结构域的结构内缺乏关键性半胱氨酸残基而不具备泛素缀合活性。人结肠癌HT-29-M6细胞经化学物质诱导发生分化时其CROC-1基因表达降低，而外源性人CROC-1基因在HT-29-M6细胞中的表达则可抑制细胞的分化及有丝分裂激酶cdk1活性，SV40-转化的无限增殖性人胚胎肾细胞中CROC-1基因高表达，说明CROC-1基因在哺乳动物细胞增殖和分化中起作用。在已分析的所有肿瘤细胞系中CROC-1基因的表达皆增高，研究发现CROC-1基因与肿瘤细胞的无限增殖化表型形成

21、有关79。本研究运用反义技术阻断CROC-1基因功能，结果发现CROC-1基因表达被阻断的FL-CROC-1- 细胞系其生长速度较对照FL及FL-MAMneo细胞的明显要慢。培养基中存在的G418及地塞米松并不会对细胞生长产生影响，因为只转染载体的FL-MAMneo细胞在G418及地塞米松存在下与FL对照细胞的生长速度无明显差异。本研究结果提示CROC-1基因编码的泛素缀合酶样蛋白在细胞生长过程中起正调控作用。CROC-1基因能功能性互补芽生酵母mms2缺陷所导致的对各种DNA损伤剂的敏感性及自发性突变率的升高，说明CROC-1及MMS 2在不同生物中功能是保守的9。已知CROC-1基因的编码

22、产物能转录激活人c-fos原癌基因启动子，c-fos原癌基因的表达为细胞抵抗各种DNA损伤剂所必需的，而这很可能是通过无误性复制后修复通路来进行的6。CROC-1基因是否与酵母MMS2基因一样，参与人体细胞内的DNA修复过程、维持基因组的稳定性，我们将对其作进一步研究。基金项目 国家自然科学基金资助 (No. 39830210)陈建明(浙江大学医学院病理生理教研室， 浙江 杭州 310031)余应年(浙江大学医学院病理生理教研室， 浙江 杭州 310031)陈星若(浙江大学医学院病理生理教研室， 浙江 杭州 310031)参考文献1陈建明，余应年. 真核泛素缀合途径研究进展J.中国病理生理杂志

23、, 2000, 16(2): 175178.2陈建明，余应年. 泛素缀合酶样蛋白的研究概况J. 国外医学分子生物学分册，1999, 21(6): 333337.3Hofmann RM, Pickart CM. Noncanonical MMS2-encoded ubiquitin-conjugating enzyme functions in assembly of novel polyubiquitin chains for DNA repairJ. Cell, 1999, 96(5): 645653.4Hu W W, Yu Y N, Chen X R, et al. Isolating the cDNA fragment inhibiting nontargeted mutagenesis in vero cell by antisense technologyJ. Chinese Science Bulletin, 1999, 44(6): 533537.5萨姆布鲁克 J,弗里奇 E, 曼尼阿提斯T.分子克隆实验指南M. 第2版. 北京:科学出版社,1992. 792793.6Rothofsky ML, Lin SL. CROC-1 e