反义单核细胞趋化蛋白-1转基因表达对单核细胞在动脉内膜粘附的影响

1、    反义单核细胞趋化蛋白-1转基因表达对单核细胞在动脉内膜粘附的影响        【摘要】目的了解动脉粥样硬化发病过程中单核细胞粘附并进入动脉内膜的机制，分析单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）基因表达对单核细胞粘附动脉内膜的作用。方法以实验性高脂血及轻度氧化LDL（MM-LDL）局部保留灌注的家兔股动脉为模型，采用DOTAP阳离子脂质体包裹LNCX-anti-MCP-1质粒，将反义MCP-1 cDNA定位导入家兔股动脉鞘及周围组织，以原位杂交、 Northern杂交及狭

2、缝杂交法观察反义MCP-1基因的表达，应用扫描电镜观察单核细胞在动脉内膜粘附的情况。结果PCR检测发现重组基因的整合，RNA水平的检测发现实验组有反义MCP-1 mRNA的表达，且实验组正义MCP-1 mRNA的表达量比对照组减少，对照组可见明显的单核细胞粘附，实验组则未见此现象。结论用逆转录病毒表达载体-阳离子脂质体介导的反义MCP-1转基因表达能减少靶基因表达并抑制单核细胞在动脉内膜粘附，为动脉粥样硬化防治提供了一个新的研究线索。【关键词】单核细胞；单核细胞化学吸引蛋白质1；RNA，反义；内皮，血管 Inhibition of monocytes adhesion to the intim

3、a of arterial wall by local expression of antisense monocyte chemotactic protein-1WU Qiang, QIAO Huihong, WANG Zongli, ZHANG Hua,LIU Peimao, XU Man, REN Guofeng, ZHAO Sanmei, SHE Mingpeng(Institute of Basic Medical Science, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijin

4、g 100005, China)【Abstract】ObjectiveTo study the mechanism of monocyte recruitment in atherogenesis and to clarify the effect of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) in this process. MethodsFemoral arteries isolated from the rabbits which had been fed with a high cholesterol diet and locally perfus

5、ed with MM-LDL within the artery beforehand, were used as the models. Antisense MCP-1cDNA was transferred into the arterial wall by injecting recombinant LNCX-anti-MCP-1/liposomal complex in the femoral sheath and the periarterial tissue. ResultsExpression of antisense MCP-1 mediated by recombinant

6、LNCX plasmid/lipsomal complex gene transfer enabled to inhibit MCP-1 gene expression and adhesion of monocyte to the intima. ConclusionMCP-1 plays an important role on the recruitment of monocytes in the arterial wall, which provides a potential clue in developing a gene therapy project for the prev

7、ention and treatment of atherogenesis.【Key words】Monocytes;Monocyte chemoattractant protein-1;RNA,antisense;Endothelium,vascular单核细胞粘附进入内皮下间隙，吞噬脂质形成泡沫细胞是动脉粥样硬化早期的病理表现。单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）是一个作用极强的单核细胞趋化因子，不仅具有吸引单核细胞移动的功能，而且对血管内皮细胞粘附分子的表达亦具有调节作用1-3，在动脉粥样硬化的发生发展过程中具有重要作用，但目前

8、对其在体内的作用及机制尚未完全了解。我们将反义MCP-1 cDNA重组表达质粒定位导入家兔股动脉鞘及动脉周围组织，观察反义MCP-1基因表达对MCP-1 mRNA表达的抑制作用，及其对单核细胞粘附进入动脉内膜的影响。材料和方法1质粒、菌株、引物：含有MCP-1 cDNA的pBluescript质粒由美国国家肿瘤研究所Yoshimura博士惠赠。逆转录病毒表达载体LNCX-anti-MCP-1质粒由本室构建4。PCR引物：P1 5-CGTGTGTTCTTGGGT-TGTGG-3；P2 5-CAGGTGGGGTCTTTCATTCC-3由美国Cybersyn生物工程公司协助设计并合成。2试剂和探针：

9、二油酰氧丙基-三甲基氨硫酸盐(DOTAP)阳离子脂质体购自Boehringer Mannheim公司，总RNA、DNA提取试剂盒购自Promega公司。32P标记正义及反义RNA探针用pBluescript-Sk/MCP-1cDNA质粒,按Promega公司RNA探针体外合成系统药盒操作手册合成。3DOTAP脂质体/DNA的制备：溶液A：羟乙基派嗪- 乙基磺酸缓冲液(HBS:20 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl, pH 7.4)稀释LNCX-anti-MCP-1超螺旋质粒DNA至终浓度30 g/ml，溶液B：羟乙基派嗪- 乙基磺酸缓冲液稀释DOTAP至终浓度80 g

10、/ml, 轻轻将两种溶液混合，室温放置15 min。4轻度氧化低密度脂蛋白（MM-LDL）的制备：密度梯度超速离心法提取低密度脂蛋白，按文献5方法用含Fe2SO4的PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）搅拌透析60 h制备并鉴定。5动物：新西兰大耳白兔，雄性，体重2.5 kg, 购自卫生部生物制品检定所。6慢性动物实验：取8只血清总胆固醇处于0.91 mmol/L的新西兰大耳白兔，任选2只做为实验组，用25%乌拉坦麻醉(1 g/kg体重)后，按Rios等6的方法手术分离暴露两侧股动脉鞘，在鞘内注射DOTAP包裹的LNCX-anti-MCP-1质粒300 l（含DNA 10 g），邻近股动脉

11、周围组织中注射生理盐水稀释的上述质粒500 l（含DNA 100 g），对照组注射等分子量的LNCX载体质粒,缝合伤口，以1.01.5 g.kg-1.d-1给动物喂食胆固醇20 d后，当每只兔的血胆固醇浓度达26 mmol/L左右取材，检测局部股动脉及周围组织中重组基因的整合、表达，扫描电镜观察股动脉内膜单核细胞的粘附。7急性动物实验：术前3 d每只兔的左腹股沟处局部肌注丁哌卡因9 mg。实验兔麻醉后手术分离暴露约4 cm长一段股动脉，结扎其分支，用动脉夹夹住两端。用注射器以肝素生理盐水冲洗后,灌注 MM-LDL(600 mg/ml)至股动脉完全被MM-LDL充盈后，阻断远侧端，保留灌注 2

12、h后恢复血流，在右侧股动脉鞘内注射DOTAP包裹的LNCX-anti-MCP-1质粒DNA，周围肌肉注射生理盐水稀释的质粒DNA，用量与慢性实验相同6。术后2 d取材,检测局部股动脉中重组基因的整合表达,观察动脉内膜单核细胞的粘附7。8原位杂交：冷冻切片经RNase、蛋白酶K处理，经预杂交后，加入-32P-CTP 标记的正义MCP-1 RNA探针，其放射活性为5×104 min/m，湿盒中保温，冲洗切片后涂布11稀释的核4乳胶（中国科学院高能原子研究所），置密闭暗盒中-20 曝光3 d，显影定影后HE染色7。9狭缝杂交及Northern杂交：参照文献8进行，提取的总RNA经电泳和紫外

13、分光光度法检测纯度，严格定量每份样品上样量为25 g。狭缝杂交为比较实验组与对照组正义MCP-1 mRNA表达量的差别，以反义MCP-1 mRNA为探针与提取的组织总RNA杂交，放射自显影后成像，经UVI像分析仪扫描，比较每组条带扫描所得吸光度值（A）的平均数。10扫描电镜标本制备：将股动脉纵行剖开，铺平、冲洗后用2.5%戊二醛4下固定2 h，PBS漂洗，1%锇酸后固定2 h，经梯度乙醇脱水，醋酸异戊酯浸泡过夜后，浸入六-甲基-二硅胺烷3 min，喷金。扫描电镜观察血管内膜表面。结果1重组基因转染后LNCX-anti-MCP-1在股动脉整合情况的检测：用与载体序列互补的P1和与MCP-1序列互

14、补的P2为引物，以提取的股动脉组织基因组DNA为模板进行PCR反应，实验组及阳性对照组皆扩增出特异片段(415 bp)，对照组则未见此片段。2重组基因转基因后反义MCP-1 mRNA在股动脉表达情况的检测：（1）原位杂交：用正义MCP-1 mRNA探针进行组织切片原位杂交，结果显示，实验组动物经重组基因转基因后股动脉壁内侧肌层平滑肌细胞有反义MCP-1 mRNA 的表达(1)。（2）Northern 杂交： 实验组皆检测到了反义MCP-1mRNA的表达，对照组则未测到反义MCP-1 mRNA的表达(2)。（3）狭缝杂交：急慢性实验的实验组MCP-1 mRNA的表达都有所减少，其中慢性实验实验组

15、股动脉中MCP-1 mRNA的表达量都比对照组少（3）。以GAPDH cDNA为探针与提取的mRNA进行狭缝杂交，结果表明反义重组基因转染不影响GAPDH的表达。1实验组动物经重组基因转染后股动脉平滑肌细胞有反义MCP-1表达原位杂交×1 0001、4：慢性实验重组基因转染实验；2、3：急慢性实验对照组；57：急性实验重组基因转染实验组2用正义MCP-1 RNA探针进行Northem杂交分析重组基因转染后反义MCP-1 mRNA的结果1：急性实验对照组；2：急性实验实验组；3：慢性实验对照组；4：慢性实验实验组3反义RNA探针进行狭缝杂交分析实验动物股动脉MCP-1 mRNA表达结果

16、3单核细胞对血管内皮的粘附情况：用扫描电镜观察可见急性及慢性实验对照组的股动脉内膜表面皆有明显的单核细胞粘附，平均每个高倍视野（×1 000）中可见35个成堆或散在的单核细胞粘附，但转基因实验组各动脉的股动脉内膜未见单核细胞粘附（47）。4急性实验重组基因转染组家兔股动脉内膜，经MM-LDL刺激后，在多数连续观察的视野中没有单核细胞粘附×1 5005急性实验对照组股动脉内膜经MM-LDL刺激作用后有成堆的单核细胞粘附×3 0006慢性实验对照组家兔股动脉内膜，在慢性实验性高脂血情况下，可见散在的单核细胞粘附在动脉内膜×1 300(左侧为同一细胞的高倍放大

17、×10 000)7慢性实验重组基因转染组股动脉内膜，在慢性实验性高脂血情况下，未见单核细胞粘附×1 190讨论单核-巨噬细胞首先进入动脉内膜并在内皮下形成泡沫细胞是动脉粥样硬化最早期的病理形态学特点，继之则发生中膜平滑肌细胞（SMC）向内膜的移动和增生。同时大量的研究（包括人体和动物实验材料）表明，在冠状动脉成形术后动脉再狭窄，搭桥手术后血管的再狭窄和在移植心脏冠状动脉中发生的以大量单核细胞浸润为特征的快发性冠状动脉闭塞的过程中均首先发生单核细胞的浸润（伴有手术创面的血小板粘附或血栓形成）。单核细胞作为人体的清道夫细胞，在动脉内膜受损部位通过清除有害因子（如过氧化脂质及其他

18、致病物质）等对机体具有重要的保护作用，但单核-巨噬细胞是一种多功能的分泌和免疫活性细胞，巨噬细胞在进行吞噬等功能活动时可释放一系列细胞因子和其他各种活性物质。如：血小板源生长因子（PDGF），干扰素（INF），转化生长因子（TGF-），白细胞介素（IL）-1等9，10。体外实验证明这些因子除可促进SMC增生和吞噬脂质外，可刺激或诱导血管壁其他细胞（如内皮细胞、SMC）相关基因的表达，形成细胞因子瀑布反应，而进一步加剧内膜损伤、SMC移动增生等10，11。因此，防止巨噬细胞进入动脉，抑制细胞因子瀑布反应将对动脉粥样硬化的防治具有重要意义。Schwartz等12证明MCP-1为作用很强的单核细胞趋

19、化因子，且有调节血管内皮细胞表达相关粘附分子的作用,显示其具有调节单核细胞粘附及进入动脉壁的双重功能，在单核细胞粘附进入动脉内膜过程中具有十分重要的作用。虽然近年的大量研究发现许多物质，如：IL-8、PDGF、IL-1、凝血酶、TXA2等均与单核细胞进入动脉内膜有关，但其中MCP-1被认为是最重要的，Navab等13用单克隆抗体进行的阻断实验表明，在血管壁细胞分泌的单核细胞趋化物质中MCP-1起最重要的作用。目前已设计出许多将基因定位导入特定节段的血管壁的有效方法14，我们按照Rios等6的方法用脂质体包裹重组逆转录病毒的方法将反义MCP-1基因导入兔股动脉鞘及周围组织，观察到重组反义基因可在

20、动脉壁表达反义MCP-1，并对动脉壁自身的MCP-1 mRNA及单核细胞在动脉内膜上的粘附有抑制作用。表明用逆转录病毒表达载体-阳离子脂质体介导的反义MCP-1重组基因的转基因表达能阻断或减少靶基因表达并产生相应的生物学效应,为动脉粥样硬化防治中可能应用的基因治疗方案提供了新的线索。（本文编辑：常秀青）基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570287)通信作者：王宗立作者单位：吴强（100005 北京，中国协和医科大学 中国医学科学院基础医学研究所病理学研究室）乔绘（100005 北京，中国协和医科大学 中国医学科学院基础医学研究所病理学研究室）红王宗立（100005 北京，中国协和医科大

21、学 中国医学科学院基础医学研究所病理学研究室）张华（100005 北京，中国协和医科大学 中国医学科学院基础医学研究所病理学研究室）刘佩毛（100005 北京，中国协和医科大学 中国医学科学院基础医学研究所病理学研究室）许漫（100005 北京，中国协和医科大学 中国医学科学院基础医学研究所病理学研究室）任国锋（100005 北京，中国协和医科大学 中国医学科学院基础医学研究所病理学研究室）赵三妹（100005 北京，中国协和医科大学 中国医学科学院基础医学研究所病理学研究室）佘铭鹏（100005 北京，中国协和医科大学 中国医学科学院基础医学研究所病理学研究室）参考文献1，Valente A

22、J,Rozek MM,Sprague EA,et al. Mechanisms in intimal monocyte-macrophage recruitment. A special role for monocyte chemotactic protein-1. Circulation, 1992,86(6 Suppl):20-25.2，Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for 1990s. Nature, 1993,362:801-809.3，Yoshimura T, Leonard EJ. Identi

23、fication of high affinity receptors for human monocyte chemoattractant protein-1 on human monocytes. J Immunol, 1990,145:292-297.4，李福生，王宗立，许漫, 等. 表达反义MCP-1的重组逆转录病毒对家兔动脉平滑肌细胞MCP-1 基因表达的抑制作用. 中国动脉粥样硬化杂志，1999，7:283-287.5，Berliner JA, Territo MC, Sevanian A, et al. Minimally modified low density lipopro

24、tein stimulates monocyte endothelial interactions. J Clin Invest,1990,85:1260-1266.6，Rios CD,Ooboshi H,Piegors D, et al. Adenovirus-mediated gene transfer to normal and atherosclerotic arteries. A novel approach. Arterioscler Thromb Vasc Biol,1995,15:2241-2245.7，苏惠慈. 原位杂交的基本步骤和原理.见：苏惠慈. 原位杂交. 北京：科学技

25、术出版社，1994.59-85.8，Sambrook J, Fritsch EF, Manitis T. Molecular Cloning, A laboratory manual. 2nd eds. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. 792-795.9，Bar-Shavit R, Kahn A,Fenton JW,et al. Chemotactic response of monocyte to thrombin. J Cell Biol ,1983,96:282-285.10，Cushing SD,Berliner JA,Valente AJ,et al. Minimally modified low density lipoprotein induces monocyte chemotactic protein 1 in human endothelial cells and smooth muscle cells. Proc Natl