Bcl2、Bax、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B在移植肾急性排斥中的共同表达和意义

1、Bcl2、Bax、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B在移植肾急性排斥中的共同表达和意义         11-01-10 14:48:00     编辑：studa20                  作者：丁小明，薛武军，田普训，刘晓东【摘要】  目的 检测Bcl2、Bax、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B

2、 在移植肾急性排斥时的表达水平，探讨其在急性排斥中的作用及可能的分子机制。方法 选取30例移植肾穿刺活检标本及18例正常供肾组织为研究对象，采用免疫组化方法检测Bcl2、Bax、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B 的表达情况。结果 根据Banff97病理诊断标准，急性排斥标本30例，其中A 12例，B 11例，A 5例，B 2例；所有组织中均可发现细胞凋亡现象，急性排斥标本中更为明显；Bcl2在急性排斥标本中的表达水平低于正常组织(P<0.05)，与急性排斥的病理变化呈负相关(P<0.05)；Bax在两组的表达水平无差别(P>0.05)；Fas、FasL、穿孔素和粒酶B在急性排

3、斥组中的表达水平均高于对照组，并与急性排斥的病理变化呈正相关，以FasL和粒酶B 最为明显(P<0.01)。结论 Bcl2在肾小管上皮细胞的表达减少提示急性排斥反应的发生；Bax对于预测急性排斥反应的意义不大；Bcl2、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B的表达变化均与急性排斥反应密切相关，尤以FasL和粒酶B明显，可作为监测移植肾形态学变化、功能状态以及判断预后的重要指标。 【关键词】  细胞凋亡；肾脏移植；急性排斥反应ABSTRACT: Objective  To detect intragraft expression of apoptotic molecules

4、(Bcl2, Bax, Fas, FasL, Perforin and Granzyme B) during acute rejection of human renal allografts, and access the role in acute rejection. Methods  Thirty tissue specimens were obtained from biopsy. The specimens were classified on the basis of the Banff criteria. Immunohistochemistry was used f

5、or detecting the expression of apoptotic molecules in the renal grafts. Results  There were 30 acute rejection specimens: A (n=12), B(n=11), A(n=5), and B (n=2). Apoptotic cells were found in all the samples, and more obvious during acute rejection. In the acute rejection specimens, the express

6、ion of Bcl2 decreased (P<0.05). Bax was found in all the samples at a certain level, and there was no significance between the two groups (P>0.05). Fas, FasL, Perforin and Granzyme B were increased during acute rejection, and there was a correlation of the expression of FasL and Granzyme B wit

7、h histological changes (P<0.01). Conclusion  The decrease of Bcl2 of the grafts indicates that it was involved in acute renal rejection. Bax could not reflect the onset of acute renal rejection. FasL and Granzyme are useful for monitoring the histology and function of renal allografts.KEY WO

8、RDS: apoptosis; renal transplantation; acute rejection尽管近年来随着器官保存、组织配型技术的发展，以及新型免疫抑制剂的广泛应用，肾移植患者的人肾短期存活率均获得了很大的提高，但远期效果并没有得到相应的改善。急性排斥反应是导致移植肾功能丧失的最主要的因素之一，但其分子机制目前尚未完全阐明。自从1995年Krams首次提出细胞凋亡是急性排斥反应可能的机制后，凋亡相关分子在急性排斥中的作用成为国内外学者的重要研究领域。凋亡相关分子在移植肾中的表达水平与急性排斥反应的发生、发展、治疗效果及移植物的功能形态变化密切相关，研究这些分子的作用机制有利于进

9、一步降低急性排斥反应的发生率，促进临床肾移植的发展。1  材料与方法1.1  研究对象及分组  实验组：1997年至2003年间肾移植术后两周内在本中心诊断为急性排斥反应的移植肾穿刺标本30例，其中男性18例，女性12例，年龄22-56岁，平均36岁；对照组：18例正常供肾作为对照。1.2  组织配型  ABO血型：血型相同者20例，血型相容者10例；群体反应性抗体(PRA)：26例为阴性，另4例分别为15%、20%、30%，40%；淋巴细胞毒交叉配型试验：均为阴性(<10%)；HLA配型：HLA位点2个抗原错配4例，HLA位点3个抗原错

10、配16例，HLA位点4个抗原错配8例，HLA位点5个抗原错配2例。1.3  免疫抑制剂的应用  术前1-2d口服环孢素A(CSA)4.5-5.0mg/(kg·d)加霉酚酸酯(MMF)1.5g/d；术前口服MMF 2.0g/d、强的松(Pred)80mg；移植术中及术后1-4d应用甲基强的松龙250-750mg/d、环磷酰胺100-200mg/d冲击治疗。术后当血肌酐降至265.2mol/L以下时开始口服CSA。术后第1天即开始口服MMF 1.5g/d，CSA起始量4.5-5mg/(kg·d)，强的松维持量10-20mg/d。1.4  急性排斥的

11、诊断和治疗1.4.1  诊断标准  临床上表现有尿量减少、体重增加、发热、血压升高、移植肾区肿大和压痛；血尿素氮和肌酐持续升高，肾功能进行性下降；B超检查：移植肾体积增大，皮质増厚，回声增强，Doppler显示移植肾血液供应差、流速慢；同位素肾动态显示移植肾核素摄取及分泌、排泄相均较差；排除其他类型的排斥反应；排除CSA的肾毒性；肾间质及血管周围大量单核细胞浸润，肾小管周围淋巴细胞聚集，有血管内膜炎；移植肾病理诊断为急性排斥反应。1.4.2  急性排斥反应的治疗  首先采用大剂量的甲基强的松龙、环磷酰胺冲击治疗2-3d。甲基强的松龙冲击治疗无效时改用抗C

12、D3单克隆抗体(OKT3)或者抗胸腺细胞免疫球蛋白(ATG)。抗排斥治疗时间7-10d，待排斥反应逆转后恢复三联免疫抑制方案。肾血管扩张药物的应用：利尿合剂的使用：盐酸多巴胺20mg、盐酸酚妥拉明10mg、速尿20-80mg、654-2 10mg，加入50g/L(5%)葡萄糖注射液500mL中静脉点滴，每日1-3次；盐酸川穹嗪120mg加入50g/L(5%)葡萄糖注射液或生理盐水250-500mL中静脉点滴，每日1次。这两种液体持续应用至肾功能恢复正常。1.5  主要试剂  鼠抗人Bcl2单抗(IgG1)、鼠抗人Bax单抗(IgG2b)、兔抗人FAS多抗(IgG)、兔抗人F

13、ASL多抗(IgG)均为美国Santa Cruz公司产品；鼠抗人穿孔素单抗(IgG)为深圳晶美生物公司产品；鼠抗人粒酶B单抗(IgG2a)，免疫组化SP染色试剂盒、DAB显色试剂盒、中性树胶均为北京中山生物技术公司产品。1.6  实验方法1.6.1  常规病理技术  移植肾穿刺标本立即放入新鲜配制的10%(体积分数)甲醛溶液中固定，12h后梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察移植肾组织中主要的凋亡细胞类型。所有组织均先按Banff 97分类标准进行诊断。1.6.2  免疫组化染色  严格按照SP染色试剂盒说明书进行，实

14、验中每种指标均设置阳性和空白对照(以PBS代替一抗)。免疫组化染色以出现明显棕黄色即为阳性结果，若DAB显色15min组织仍无着色则为阴性结果。所检测蛋白表达半定量：50%以上的肾小管呈阳性表达；：25%-50%的肾小管呈阳性表达；+：25%以下的肾小管呈阳性表达。1.7  统计学处理  用Wilcoxon两样本比较法进行统计分析，用Spearman等级相关分析。统计分析利用SPSS10.0软件进行，以P<0.05为差异有统计学意义。2  结果2.1  Banff 97诊断分类1  急性排斥反应组中，A(明显的间质浸润，即25%以上实质受累；中度小管炎病灶，即>4个单核细胞/每小管横断面或10个小管细胞)占40%，B(明显的间质浸润；严重小管炎病灶，即>10个单核细胞/每小管横断面或10个小管细胞)36.6%，A(轻度到中度动脉内膜炎)16.6%，B(严重动脉内膜炎，管腔狭窄25%以上)6.6%。2.2  移植肾组织中的细胞凋亡  HE染色可见，凋亡细胞的核呈蓝黑色，胞浆为淡红色，单个散在地分布在组织中。表现为核染色质致密浓缩，核碎裂等，可发现凋亡小体。依