挑战杯立项申报书------罗蓉

1、精品与精品编号：暨南大学“挑战杯”竞赛等学生课外学术科技创新创业竞赛项目立项申报书类别： A.哲学社会科学类社会调查报告和学术论文（哲学、经济、社会、法律、教育、管理）B.自然科学类学术论文（机械与控制、信息技术、数理、生命科学、能源化工） C.科技发明制作类（机械与控制、信息技术、数理、生命科学、能源化工） D.创业计划类（产品、服务）项目名称： HD通过ROS途径影响鸡胚心脏发育 所属学院： 医学院 申报负责人： 罗蓉 指导老师： 程欣 推荐专家： 杨雪松 教授 一、申报者情况说明：A、B、C、D类项目均需填写此页。申报负责人情况姓名罗蓉性别女出生年月1993年4月学号2011053057

2、学 历本科生 研究生院系、年级医学院2011级宿舍地址学生宿舍9栋418室E-mailluorong8820手机号Q号码1308541774其他申报者情况姓 名性别学院、年级学 历学号郑锦鉴男医学院2011级本科2011051986李永盛男医学院2011级本科2011051975申报项目为：个人项目/ 集体项目。资格认定以上申报者均为我校正式注册的全日制本科生或研究生。院系教务秘书签章：年 月 日二、申报项目情况说明：A、B、C类项目填写此页。项目名称HD通过ROS途径影响鸡胚心脏发育项目的基本内容、意义摘要、研究思路和方法基本内容： 正己烷是一种低毒、高挥发性、高脂

3、溶性并有蓄积作用的高危害性饱和脂肪烃类毒物,作为有机溶剂，在印刷、油漆、电子器件清洗、粘胶、制鞋、家具、运动器材及干洗等行业中广泛使用。目前关于正己烷毒性研究主要以周围神经损伤为主，有关其胚胎毒性、致畸性的研究少见报道。2,5-己二酮（2,5-hexanetione, HD）是正已烷体内代谢的终产物，也是正己烷中毒的主要神经毒作用物，分子式CH3COCH2CH2COCH3，分子量114.14，属于低分子量化合物。文献报道HD可以提高血-神经屏障的通透性1，及暴露于正己烷环境的孕鼠体内HD的浓度与全部胎鼠体液HD浓度相当2，可见，HD能通过血-胎盘屏障对胎儿的生长发育造成影响。我们前期研究发现，

4、较长时间暴露于HD可致鸡胚发生明显的神经系统发育畸形如神经管未闭合（NTDs）3、大小眼畸形等，及脊柱侧弯（该项目获2011年暨南大学大学生挑战杯立项，项目完成人：陈云玉，目前已如期结题并发表论文，见参考文献3）。同时，在前期实验中发现，处于发育早期的胚胎接触了正己烷后，在较短时间内出现较高的死亡率，因此推测，HD可能对提供胚胎发育必须条件的血管发生、发育产生影响。我们进一步采用在体培养，观察了经HD处理的鸡胚，其早期血岛发生、及为胚胎提供营养的卵黄膜、尿囊膜发育的情况，发现低浓度的HD刺激血管发生和卵黄膜、尿囊膜的发育，而高浓度HD表现出明显的胚胎毒性。这部分内容获得2012年校创新工程立项

5、，由2011级临床医学专业许长俊、罗蓉承担，目前已完成中期内容审查，实验结果正在整理中。因此，本研究计划在前期实验的基础上，观察HD对鸡胚发育过程中，心脏形态、机能的影响，并检测HD损伤过程中，ROS相关指标的变化，探讨HD影响心脏发育的可能作用机理。意义摘要： 心脏是胚胎发育过程中第一个形成的器官，其在胚胎发育过程中的重要作用无需赘言，通过胚外血液循环、胚体本身心血管发育，为胚胎发育提供营养、氧气并进行代谢。心脏发育过程中，对外界因素非常敏感，一旦受到环境因素的影响出现异常，整个胚胎的发育将受到严重影响4,5。鸡胚发育周期短、易于培养且便于观察记录，发育早期与人胚发育特征高度契合，使之成为研

6、究胚胎发育早期相关影响的良好动物模型6。本实验通过观察HD对胚胎循环系统发育的影响，尝试阐明其可能的作用机理，为育龄期妇女劳动卫生安全保障提供有力的实验基础资料。研究思路与方法： 本研究以鸡胚为研究对象，试图探究HD对胚胎发育过程中心脏机能和形态的影响，为预防和治疗正己烷中毒提供实验基础和依据，完善对正己烷中毒和HD毒性研究的实验资料。 取蛋内孵育的鸡胚，经不同浓度的HD处理9d，13d后取胚，观察记录鸡胚体重、表型等大体指标，常规组织学石蜡切片制备，HE染色、massion染色、免疫荧光等观察鸡胚心壁的形态结构变化；小动物B超获取心脏功能相关指标。同时取鸡胚心肌组织匀浆，提取蛋白，测定经HD

7、处理后，通过心肌组织氧自由基产生量、SOD、MDA等几个方面的变化，评估HD对心肌的毒性作用。 技术路线如下图所示：参考文献：1 Liu Q, Duan H, Dai Y, Niu Y, Chen H, Liu Q, et al. The effect of 2,5-hexanedione on permeability of blood-nerve barrier in rats. Human & experimental toxicology. 2010;29:497-506.2 Bus J, White E, Heck H, Gibson J. The distribution and

8、metabolism of n-hexane in pregnant Fischer 344 rats. Teratology. 1978;17:42A.3 Xin Cheng, Guang Wang, Zheng-lai Ma, Yun-yu Chen, Jing-jing Fan, Zhao-long Zhang, et al. Exposure to 2,5-hexanedione can induce neural malformations in chick embryos. NeuroToxicology, 2012, 33(5): 1239-1247.4 杨晓冉、赵保忠、崔景荣.

9、 -七叶皂苷钠对鸡胚血管新生的影响，中国新药杂志，2006，15（11）：5 刘静霞, 龙超良, 杨永林, 汪海. 1H-异吲哚-1, 3( 2H)-二酮新衍生物对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的抑制作用研究. 中国药理学通报, 2004, 20(12): 13751378. 6 王恒，等.鸡胚模型在生物研究中的应用进展。生命科学, 2009，21（2）：312-315.项目拟解决的技术难点以及预期达到的目标、主要技术指标和水平技术难点：1. 鸡胚整胚切片制作。因为经有机化合物处理后，鸡胚组织脆性增加，切片组织易碎。同时在切片上保证切片平面和部位的一致性以便比较具有一定难度；2. 鸡胚心脏组织匀浆后，

10、蛋白提取的量和纯度；3. 摸索及稳定鸡胚心脏B超观察机能改变的条件。预期目标：1. 通过观察HD对鸡胚心脏发育过程中，心功能和心壁形态学的改变，及HD处理后鸡胚心脏ROS相关指标的改变，阐明HD胚胎毒性的可能机理；2通过参加科研活动，锻炼科研思维、掌握基本的科研方法;3发表1篇B类及以上研究论文。主要技术指标和水平：1. 鸡胚蛋内培养。不同浓度HD经气室给药处理HH11+期鸡胚，每隔3d重复给药一次，药物作用时间为7.5d、11.5d，设PBS对照；2. 采用小动物B超仪，检测HD处理后鸡胚心率、射血分数等心功能指标的变化；3. 取鸡胚心脏，体式镜下拍照；4. 采用常规形态学石蜡切片及染色技术

11、，对心脏的形态变化进行观察；采用IPP软件，测量及计算心壁厚度、心壁中血管面积、密度，SPSS统计软件处理结果；5. 组织切片免疫荧光染色，观察HD对心肌细胞表达MF-20的影响；6. 心壁组织匀浆，提取蛋白，通过DCFH荧光染色后分光光度法检测HD作用后，心肌产生ROS的情况，试剂盒检测心脏MDA、SOD的变化。项目研究内容的发展现状与趋势，与项目有关研究领域的基础以及专利申请和授权情况项目研究内容发展现状：1. HD对循环系统的影响1957年，意大利报道了首例“制鞋工人中毒性周围神经病”，之后，正己烷中毒在发达国家陆续曝光。由于初期对其认识不足而致防护不当，1968年日本1662名塑料凉鞋

12、制造工人因接触正己烷发生周围神经病。此后，美国、加拿大、巴西、南非、台湾等地陆续有正己烷慢性中毒的报道。至20世纪90年代，其发病率在发展中国家呈现上升趋势。大陆地区于1989年出现首例中毒报道。至今20余年过去了，职业接触正己烷中毒已经成为我国严重的职业病之一。尤其是近年来，加工业快速发展，在制鞋、电子元件生产、箱包加工等行业，正己烷慢性中毒已经成为有机溶剂职业中毒的代表病种。正己烷主要影响神经系统，对黏膜也有刺激作用，通过呼吸道、消化道、皮肤进入接触者体内，发病缓慢而隐匿，因此正己烷极少出现严重急性中毒，也正因如此而被轻视，日积月累的长期接触无异于慢性下毒。制造行业有大量女工在怀孕后因较强

13、的工作强度而辞工，同时因经济条件的限制缺乏细致孕产记录跟踪，这也是导致有关正己烷是否具有胚胎毒性的流行病学资料较少的一个原因。正己烷具有心脏毒性。劳动卫生资料报道，30名接触正己烷、二甲苯和甲苯混合物的工人的心电图检查显示，其心脏自律性神经，尤其是副交感神经兴奋性有改变。研究证实，大鼠连续90天皮下注射200L正己烷：橄榄油（1:1 v/v）的混合液后，外观观察与对照组并无明显差异；分离心脏，采用Langendorff系统离体灌注，冠脉血流量和心率与对照组无差异，但是心室纤颤阈（ventricular fibrillation threshold，VFT，简称室颤阈 ）和电解质镁、钾和锌的水平

14、与对照组相比都有明显降低，经胃饲补充镁和钾后，室颤阈仍然异常，提示正己烷可以诱发心律失常。而室性心率失常是导致猝死的重要因素之一。进一步形态学研究表明，超微结构的改变是心肌功能受影响的主要原因。2. HD毒理作用的可能机制对于正己烷及其代谢产物HD毒性作用的机理，研究较多集中在其神经毒性。发病机制尚不完全清楚，得到认可的，有能量代谢障碍、轴浆转运障碍、神经丝衍生和交联等几种假说。研究表明，HD可抑制糖酵解酶的活性，导致线粒体合成ATP不足，使神经元能量代谢障碍，Na+-K+-ATPase不能把胞内多余的Na+和胞外多余的K+运出和运入细胞，造成细胞内外的Na+、K+浓度差减小，使膜电位和神经冲

15、动减弱，神经传导速度减低，慢性中毒的病人出现手足发麻、刺痛、蚁走感和运动障碍。关于正己烷中毒性神经病发病机制的另一学说是轴浆转运障碍。能量产生不足导致轴浆运输障碍，特别是顺向慢速轴浆运输抑制，在胞质合成的细胞骨架成分不能及时运送到轴突远端及末梢，造成神经丝（Neurofilaments, NFs）积聚过多。另有研究显示，HD能与NFs的赖氨酰基反应形成吡咯衍生物，吡咯衍生物发生氧化成为亲电子物，而后与蛋白质亲核物反应形成NFs交联。这种分子内和分子间NFs交联的形成，损害NFs的顺向轴浆运输，使其不能通过狭窄的郎飞结，从而引起NFs的聚集，最后导致轴索的肿胀和变性。但是目前尚无明确的证据证实神

16、经毒素或其他因素导致NFs的聚集可引起轴浆转运减慢和轴突退行性变。有些研究研究表明，HD引起的暂时性的和可重复性的逆向轴浆转运障碍并不与进行性的NFs堆积呈明显的相关性。转基因小鼠模型研究也显示NFs堆积并不能导致退行性变发生。上述几种机制，也只能部分解释正己烷中毒性神经系统疾病的发病机制。由于正己烷使用的历史只有几十年，而且能够追踪到的临床症状最多表现在神经系统，因此相关研究资料有限，尤其是针对神经系统之外的其他症状。研究基础：在前期承当项目“2,5-HD对血管发生发育的影响”实验中，我们已获得一些实验数据，并将结果进行了统计分析：（1）肉眼观察0h时不同浓度低浓度2，5-HD对鸡胚的影响情

17、况，如表1：表1 0h 加药情况浓度梯度 （ mol/L） 样本含量 （胚数） 加药量（l/胚）加药0h胚胎情况 0.02 12 50 无死亡 0.1 13 50 无死亡 0.5 6 50 无死亡（加药一侧血液积聚，有类似出血状） 1 6 50 2个胚死亡 （2） 对照组中，卵黄膜血管正常发育。随着培养时间增加，卵黄膜血管向外延伸，血管逐渐增粗，分支不断增多。0.02 mol/L 2,5-HD浓度组中加药侧可见卵黄膜血管发育较为正常，与对照组血管发育情况相似，在形成的血管大小，密度以及血管网区域面积上无明显差别，两侧血卵黄膜管网呈对称状分布； 0.1 mol/L 2,5-HD浓度组中加药侧可见

18、卵黄膜血管发育与对照组相比，血管发育较快，形成的血管较粗，血管数目及血管分支较多，该侧血管网区域所占面积以及血管密度较大（如图1），其发育趋势（以血管网在硅胶环内的位置为指标）得到数据如图2：图1 control表示对照组；0.02M、0.1M均表示实验组；箭头表示指示卵黄膜血管发育位置。图2（3） 0.5 mol/ L 2,5-HD浓度组中在加药后可见明显的出血淤血现象；1 mol/ L浓度组1、2号胚在加药后1h内死亡，其余存活的鸡胚中，加药区蛋白质有似凝固变性现象。两浓度鸡胚及其卵黄膜血管发育迟缓，形成的血管明显稀疏细小且有病理状扭曲，怀疑为高浓度药物的急性毒性作用。因两浓度的胚胎淤血或

19、死亡对实验统计数据产生一定影响，故在数据处理中已经略去。（4）用IPP数据处理软件进行分析发现，0.1 mol/ L2,5-HD对卵黄膜血管网的发育起增生作用最明显，统计结果如下（如图3）：图3 spss软件进行重复测量设计的方差分析并作出不同浓度组卵黄膜血管密度趋势图比较（5）鸡胚在0.1 mol/L2,5-HD的培养基上生长未能成活至HH8，可能是药物浓度太高，胚胎死亡。但是在培养过程中发现，实验组胚盘长势较对照组差，猜测是药物的刺激抑制生长。预期研究成果应用、转化的前景预测及分析通过观察鸡胚心脏发育过程中，2,5-HD对胚体心脏形态和功能的影响，及ROS相关指标的变化，揭示正己烷在发育过

20、程中的胚胎毒性作用，并探讨2,5-HD影响心血管发育的可能作用机理，为全面认识正己烷职业毒性和作用机制提供有力的实验基础资料；同时，在本实验结果的基础上，可以进一步探求改善正己烷损害的药物，将直接带来明显的经济和社会效益。说明：A、B、C、D类项目均需填写以下页。研究工作条件与基础1. 暨南大学医学院组胚教研室从事胚胎早期发育的仪器设备俱全，加上中心实验室提供的科研平台，完全可保证实验所需仪器，满足了展开实验的客观条件。2. 有程欣老师、王广老师和一批优秀的、正在从事发育生物学研究的博士生、硕士生做指导，是本实验顺利开展的坚实基础。3. 队员都是临床医学的本科生，对鸡胚正常的发育已掌握初步的基

21、础知识。研究工作计划及进度（各实施阶段目标和内容）2013.8-2013.9用不同浓度的2,5-HD处理鸡胚，取胚，体式镜拍照，获得大体指标，并统计2013.10-2013.12固定取好的胚体切片制备，常规组织学染色、免疫荧光染色2014.1-2014.32,5-HD处理鸡胚，取胚体心脏，小动物B超测量心脏相关功能指标的改变2014.4-2014.72,5-HD处理鸡胚，取胚体心脏，体式镜拍照，组织匀浆，测量ROS相关指标2014.8-2014.10整理结果，统计分析，撰写论文团队的学科搭配和梯队建设情况研究项目团队有2名指导老师（副教授1名，助教1名），3名临床医学专业学生。研究团队搭配合理

22、，有良好的专业背景。项目组指导老师的研究方向为发育生物学，从事鸡胚早期发育研究具有丰富的经验，发表过多篇相关SCI文章，并作为主要承担者参加多个科研项目；实验小组成员成绩优异，基础扎实，有较好的外文阅读与查阅整理资料的能力，已阅读30多篇相关文献，掌握了本科研项目的背景知识及发展动态。团队负责人罗蓉现参与2012年第三批暨南大学大学生创新创业训练计划校级项目2，5-己二酮对鸡胚循环系统发生发育的影响，现已通过中期审查，在项目研究过程中积累了较强的动手能力和实验基础，以及团队组织能力，能够很好地完成实验项目。队员郑锦鉴、李永盛，参与暨南大学大学生创新创业训练计划项目“乳岩内消霜外用对乳腺癌前病变的阻断作用及其机理研究”，已通过中期审查，获得一定的外文文献查阅能力。团队成员均为大二临床医学专业的学生，在实验过程中的交流、沟通较为方便。其次，本组成员已查阅了很多有关鸡胚血管发育HD的相关内容，已初步掌握了许多有关本实验的基本内容。经费申请金额、经费用途和使用计划申请经费：10,000元经费用途及计划： 鸡胚 600元 药物（2,5-HD） 800元 免疫荧光试剂（一抗MF-20及荧光二抗） 2,000元 小动物B超实验