一氧化氮在成兔与胚胎兔创面愈合过程中含量的比较

1、    一氧化氮在成兔与胚胎兔 创面愈合过程中含量的比较        摘要目的：分析胚胎无瘢痕愈合的潜在原因，研究NO(一氧化氮)在成人型和胚胎型愈合过程中的差别。方法：在已建立的胎兔创伤模型的基础上，用一氧化氮酶法试剂盒检测胚胎兔和成兔皮肤匀浆液中NO的含量，并对结果进行比较。结果：正常胎兔不同孕期皮肤中NO含量无差别。正常胎兔皮肤中NO含量高于正常成兔皮肤中NO含量(P0.01)。创伤胎兔皮肤中NO含量高于正常胎兔皮肤中NO含量(P0.01)。创伤成兔皮肤中N

2、O含量高于正常成兔皮肤中NO含量(P0.01)。创伤胎兔皮肤中NO含量高于创伤成兔皮肤中NO含量(P0.01)。结论：NO参与了胚胎和成年动物的创面愈合过程，并在两种愈合过程中存在差别。关键词一氧化氮胚胎创面愈合 The role of nitric oxide in fetal and adult rabbit wound healingHuang Wei, Liu Dalie（Department of Plastic Surgery, Shenyang Army General Hospital, Liaoning110015）AbstractObjective: By investig

3、ate the difference of nitric oxide contents in adult and fetal rabbit wound healing, it was expected to probe the potential reasons of fetal scarless wound healing. Methods: On the formerly established fetal rabbit wound healing model, we detected nitric oxide content in fetal and adult skin homogen

4、ate and compared the results. Results: 1.There was no difference of nitric oxide content in normal fetal rabbit with different pregnant time. The content of nitric oxide was higher in: 2.Normal fetal rabbit skin than that of normal adult rabbit (P0.01). 3.Wound fetal rabbit skin than that of normal

5、fetal rabbit (P0.01). 4.Wound adult rabbit skin than that of normal adult rabbit (P0.01). 5.Wound fetal rabbit skin than that of wound adult rabbit (P0.01). Conclusion: There are differences of nitric oxide content in two types of wound healing. Nitric oxide participates in the process of festal and

6、 adult animal wound healing.Key WordsNitric oxide, Fetus, Wound healing胚胎无瘢痕愈合的特性日益引起人们的重视。对此现象的研究不仅为子宫内手术治疗某些先天性畸形提供理论依据，而且为瘢痕的防治提供一些启示。NO是一种无机小分子，它广泛存在于脊椎动物的各种细胞中。近年来有关它的作用成为研究的热点。一些动物实验和临床研究表明，创伤后NO的含量有变化，并有证据表明NO参与创面愈合过程。但国内外文献尚未见报道NO在胚胎无瘢痕愈合过程中的作用。本文观察了成兔和胚胎兔创面愈合过程上NO含量的变化，以期探讨NO在创面愈合过程中的作用。1材料

7、和方法1.1实验动物实验动物由我院动物实验科提供。将怀孕18天身体健康体重在3.55kg之间的中国本兔隔离饲养。于23天时手术，同时将年龄在58个月之间，体重在1.82.2kg之间身体健康的非孕兔在手术前45天亦分离饲养。观察期间喂高营养饮食。注意其精神状态及活动情况。1.2主要试剂及仪器864合剂(长春兽医大学药厂)；青霉素(大连制药厂1.6万/ml)；PBS缓冲液(0.01MpH 7.4)；一氧化氮酶法试剂盒(深圳晶美生物技术公司)；组织粉碎机(上海医疗器械厂)；玻璃匀浆器(上海医疗器械厂)；恒温高速离心机(西门子医疗仪器公司)；自动恒温孵育(上海医疗器械厂)；紫外分光光度计(美国PE公司

8、)。1.3动物模型的制作和样本的收集处理动物模型的制作取怀孕23天的孕兔18只，随机分为6组，每组3只，组号16。另取非孕兔24只随机分为7组，组号17，前6组每组3只，第7组6只。在864合剂肌注麻醉下将孕兔行剖腹手术。每只孕兔分别取出两只胎兔行手术，它们分别位于不同子宫角内，以孕兔背部为中心，用3-0丝线作内外两个椭圆形荷包缝线，于中心用尖刀切开子宫壁及羊膜，暴露胎兔臀部及背部，在其背部作长约1.5cm的皮肤全层切口，用6-0丝线间断缝合后将胎兔回纳子宫内，收紧内荷包，打结前向子宫内注入适量含青霉素的温生理盐水，结扎两荷包线，逐层关腹。16组的非孕兔亦在麻醉下分别在其背部做长约2cm切口，

9、3-0丝线间断缝合，第7组为正常成兔组。分别将16组的孕兔于手术后16天再次行剖腹产术，每只母兔除将创伤胎兔取出外，同时各取两只正常胎兔(孕2429天)，拆除创伤胎兔背部缝线，以切口为中心做长1cm，宽0.5cm的切口，切下全层皮肤，同样切取正常胎兔背部对应的皮肤。17组创伤成兔及正常成兔皮肤的切取方法同上。这样共获得4个大组，正常胎兔组，创伤胎兔组，创伤成兔组，正常成兔组。前三组内共有6个小组。正常胎兔组(孕2429天)，创伤胎兔及创伤成兔(创伤后16天)每小组有6个样本。正常成兔组为一个组，有6个样本。总共114个样本。1.4检测严格按照一氧化氮酶法试剂盒说明书中的要求操作，设置空白对照，

10、以空白管调零，在530nm波长下用紫外分光光度计读取测定管和标准管OD植，计算公式：一氧化氮(mol/l)=测定管OD值/标准管OD值×100。1.5统计学处理每组样本用?Ax-U?±s来表示，用SPLM统计分析软件进行方差分析及两两比较，团体检测来进行显著性检验。2结果从表中可以发现(表1)，正常胎兔不同孕期皮肤中NO含量无明显差异，但却明显高于正常成兔皮肤中NO的含量(P0.01)。成兔创伤后皮肤中NO的含量比正常成兔皮肤中NO含量明显升高(P0.01)。胎兔皮肤创伤后NO的含量也明显高于正常胎兔皮肤中NO的含量(P0.01)。创伤成兔与创伤胎兔相比，后者NO含量明显高

11、于前者(P0.01)。胎兔皮肤损伤后16天NO的含量无明显差异。成兔皮肤创伤后第2天NO含量明显高于其他几天(P0.05)。3讨论NO的生物学作用极其广泛，涉及到心血管、中枢神经、呼吸、消化、内分泌、泌尿生殖等诸多系统，近年来发现其在创伤及创面愈合过程中具有重要作用。创面愈合过程中聚积于创面的中性粒细胞、血小板、成纤维细胞、新生血管的内皮细胞、创面残留皮肤、创缘皮肤覆盖创面皮肤中的角朊细胞或移植于创面的角朊细胞，均能成为NO的来源1。NO化学性质活泼，与分子氧反应生成NO2并很快转化为NO?3和NO?2，NO?2又进一步转化为NO?3。本实验采用一氧化氮酶法试剂合，通过硝酸还原酶特异性地将NO

12、?3还原为NO?2，通过检测NO?2、NO?3浓度之和作为NO生成的指标，更能真实地反映组织中NO产生的量。本实验表明，无论是成兔还是胚胎兔创伤后NO的含量均有升高。Schaffer等2证实伤口内NO的代谢产物是由伤口内各种细胞产生的，而非液体渗出所致。创伤后伤口内各种参与创伤修复过程的细胞聚积，这些细胞中很多就能产生NO，因此创伤后NO含量升高。创伤成兔在创伤后第2天NO含量达到高峰，同创伤后其它几天相比相差显著(P0.01)，其它几天NO含量虽相关不明显，但呈中间高两边低的形势。分析其中原因可能为创伤后第2天，创面内各种细胞聚积最多，释放的NO也相应增多。另外，创伤后伤口内的诱生性NO合成

13、酶(iNOS)活性增高，NO产生量也相应增多。而iNOS的激活需要通过基因表达，mRNA转录和转录后修饰等一系列过程来完成。创伤后第2天NO含量升高与iNOS的激活过程是一致的。Preiser JC3等报告烧伤病人血浆NO含量于烧伤后第2天达到高峰。本文的结果与上述作者的结果一致。创伤胎兔于创伤后16天NO含量无显著差异。但创伤胎兔皮肤中NO含量明显高于创伤成兔。其中原因尚不清楚。由于正常胎兔皮肤中NO含量也较正常成兔高，因此推测：NO可能在胚胎发生中发挥一定作用。胚胎组织代谢旺盛，有报道说NO是细胞间的一种信使，所以胚胎组织本身NO含量亦多，但其中机理尚需要进一步研究。Rowsell AR4

14、研究认为，胚胎伤口中只有很少甚至完全没有胶原沉积。我们的研究也显示成兔伤口愈合时有大量成纤维细胞的胶原填充(1)，而胎兔伤口填充的为细纤维(2)，与他们的结果相同。Krik SJ5等研究发现，向创伤小鼠伤口内注射NOS抑制剂L-NMMA后，伤口液体中NO含量降低，同时测量羟脯氨酸(OHP)含量升高。这说明NO的产生能抑制胶原的合成。因此推测胚胎创伤愈合过程中高NO有利于降低胶原的合成。这也许是胚胎无瘢痕愈合的一个原因。表1胎兔及成兔在正常情况下和创伤后NO含量(mol/L ?Ax-U?±s)组正常成兔创伤成兔正常胎兔创伤胎兔110.424±2.75729.930±

15、2.68719.163±2.98944.441±4.740234.635±1.83020.849±3.24146.443±6.650331.168±2.05819.232±1.96046.279±4.640430.871±1.84220.313±3.00946.645±4.582530.366±2.70121.951±3.39149.381±8.147629.890±2.13120.250±2.81246.640±6.5561

16、成兔创伤后第6天，伤口开始愈合，伤口内有大量成纤维细胞和胶原填充2胎兔创伤后第4天，伤口基本愈合，并充满细纤维NO对创面愈合的作用表现在多方面，包括炎症反应，血管再生，创面肉芽组织生成和皮肤血液供应等。目前有关NO与胚胎无瘢痕愈合的研究国内外未见文献报道。本文只是对胚胎愈合过程中NO含量的变化作一观察，其中许多问题尚需要进一步研究。例如NO与炎症的关系，NO与细胞外基质沉积以及NO与细胞因子调控的关系等均有待进一步深入研究。黄威（110015沈阳军区总医院整形外科）柳大烈（110015沈阳军区总医院整形外科）参考文献1，倪俊. 一氧化氮与创面愈合. 国外医学. 创伤与外科基本问题分册, 1997, 18(3): 132.2，Schaffer MR, Tantry V, Gross SS, et al. Nitiric oxide regulates wound healing. J Surg Res, 1996, 63(1): 237.3，Preiser JC, Reper P, Valasselaer D, et al. Nitric oxide production is increased in patients after burn injury. J Trauma, 1996, 40(3): 368