蛋白质组分析中mutans链球菌酸碱代谢表型 - 猪八戒网

1、蛋白质组分析中mutans链球菌酸碱代谢表型爱丽丝,德里克·林之Harty和尼古拉斯·a .雅克牙科研究所,Westmead千年研究所和Westmead口腔保健中心、宝箱、新南威尔士、533、Wentworthville 2145澳大利亚摘要二维凝胶电泳分析蛋白质的mutans链球菌生长在一个稳定的状态glucose-limited厌氧连续大量的蛋白质,揭示了不同的表达当增长了降低pH值7从0到pH值五0。在表达的变化通常是限于蛋白质代谢生化途径:糖酵解作用,三酸的生产,选择branched-chain氨基酸的合成。相关的蛋白表达点代表所有的酶,所有的Embden-Meye

2、rhof-Parnas通路但是酶的主要路径选择的s . mutans酸发酵,被确认和计量。蛋白质组数据,结合产品和cell-yield分析,是符合表型变化,允许mutans .在低pH值,通过扩大增殖能量挤压多余的细胞,H +从最小的不利影响,造成的碳通量的去偶从代谢和随之而来的失衡和丙酮酸生产NADH。酶含量的变化与减少形成强烈的酸、甲酸,那是一种后果,两者的丙酮酸乳酸、branched-chain氨基酸的生产时的mutans .培养了酸性环境。缩写:2-DGE、二维凝胶电泳技术;ASB-14,amidosulfobetaine-14;D、稀释剂、微分表达式;德(价值)、肺、固定化pH值梯度

3、;IPS,细胞内的多糖,MALDI-TOF,matrix-assisted激光解析电离飞行时间;PEP-PTS、磷酸葡萄糖phosphotransferase系统;PMM:大众映射,YATP、肽,ATP产量、干重、YGlc细胞组分ATP产量、干重、细胞的细胞组分葡萄糖龋齿的临床与acidogenic细菌和aciduric分泌和容忍有机碳水化合物代谢副产品酸性发酵。通过他们的demineralizing珐琅质,这些行为都开始有机酸,该疾病的病因学的。在过去的50年间,研究着眼于龋齿的口腔链球菌,特别是链球菌mutans,这是现在的接收与启蒙的各种形式的疾病(Hamada &斯莱德,198

4、0年,哈珀和莱莱,1986年,1984;1994年成立;Houte;范·Ruyven,等,2000年)。大量的研究一直致力于研究,特别是链球菌糖类新陈代谢的生理生化、mutans产酸允许s和生存在低pH值在口腔。从历史上看,这个研究已经雇了一个简化方法研究生物化学过程的监管等构酶和改造的通量的代谢物(Iwami &山,1980年,汉密尔顿,1984年,山田,1987;Carlsson和汉密尔顿,1996;Quivey等,2001年)。一些最近的报告,然而,利用更整体战略体系由蛋白质组分析aciduricity机制mutans位点。例如,一个二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DGE分

5、析的14C-labelled细胞内蛋白质显示64蛋白质上调,49,下调,当细胞从pH 7震惊,pH值五五0。身份,这些蛋白质有待确定(Svensater等,2000年)。在相关的研究中,18种蛋白上调和12下调当相对2-DGE蛋白质组之间的mutans .生长在一批文化、无酸度控制,从开始的酸碱值0 - 5七2。27个蛋白,由大众光谱分析13被卷入糖运输和中央新陈代谢(威尔金斯等,2002年)。在后者的报告,mutans是采集和分析,在此阶段mid-exponential阶段的酸碱值的两种不同的文化已经下降到6二、四7。取得了显著不同繁殖世代数,1h和六0 - 6小时,在这两个小灵通威尔金斯(

6、。这种变化的pH值进行批量文化的理解中观察到的改变蛋白质很难评价的关系,仅从批文化从细胞已经连续回应一个不断变化的外部环境。相比之下,continuous-culture法应用于该研究的优势,使细胞被取样条件下严格界定稳态,从而使真的比较蛋白质组分析个人参数改变。在目前的研究中,蛋白质的s . mutans,生长在稳态在pH 70人工唾液中,定义了已经相比,细胞生长在pH值五0。该方法已被选来模拟条件的牙菌斑和健康的个体相比,更容易的主人。同时,从某种程度上来说,本文分析了表型的适应程度,在酸性容忍它显示变动而变动的表达的蛋白质代谢途径的限制;特别是,关键生产、糖酵解过程、酸branched-

7、chain合成的氨基酸。相反,在前人研究Svensater(2000):或少于18 %(威尔金斯等,2002年)的蛋白质在这些途径进行检测,该研究还发现了83的酶在这三个生化途径。这个数据是一致的mutans .假设的酸性环境相适应,通过最小化,使用H +生产的一系列不同的策略。是这样,尽管消耗ATP所需的H +挤出和合成去偶碳利用合成代谢过程。生长和菌株的条件。mutans LT11连续文化葡萄球菌(道等,1993)生长在厌氧条件下在稀释比率(D)为0001 h-1 100±0,pH 71或0±0在pH值五1 0±0与葡萄糖的营养,如前述(雅克等,1979年)。

8、采用数字媒体,没有黏液,但是修改包括尿嘧啶、鸟嘌呤、腺,年方二十,实已垂垂老矣µg ml-1 15毫米,KH2PO4和15毫米K2HPO4(席森斯等,1991)。分析表明,mutans葡萄糖有限是. . D = 0 - 1 h-1,无论在pH值和pH值0 - 7五0,因为998%和99九%,分别在介质中的葡萄糖被利用,而所有的补充氨基酸仍然超过75%(平均利用率,在pH 70 - 72 %,pH值五0)。准备对细胞内蛋白质。当稳态已经达到,细菌培养容器的内容获得大丰收,清洗和冻干前,aliquots(10毫克的干重的细胞)和mutanolysin(林等,2003年)。蛋白质能被分离对

9、酸性固定化pH值梯度(1986)条(pH 47)中提取0-6如(林等,2003年),除了1%(w / v)amidosulfobetaine-14 65毫米(ASB-14)和金红石被加入产生一种改性solubilizing 2-DGE解决方案。虽然这些药剂的总人数的增加蛋白质,可随时辨识2-DGE凝胶,他们的加入选择性抑制或以后的提取分离的一小部分弱表达蛋白,此前可视化和/或鉴定2-DGE凝胶(林等,2003年)。蛋白质在基本分条(pH 6-11观测得到mutanolysin-treated)是由一个two-fraction细胞增程序。以下的细胞lysate离心(12万4°C,10分

10、钟),细胞颗粒被储存在- 20和蛋白质沉淀在浮在一夜之间是有15 - 20°C的%(w / v)trichloroacetic酸。下列离心法(12万4°C,10分钟)和两个洗在甲醇、沉淀蛋白在300µl之前进行的一个1:1混合后的解决方案(没有ASB-14增)和细胞和媒介膜Solubilizing试剂(西格玛奥德里奇),含有1%(v / v)和2毫米tributylphosphine X-100鹤。冷冻细胞颗粒被解冻,然后由sonication(布兰森超声波resuspended;50 W,10x10冷却,以相互之间爆发)冰700µl相同的增的解决方案。

11、Exonuclease III(150 U)中,悬挂著室温(20-22ºC),持续15分钟,使任何DNA。这两个细胞然后组合和判读室温(12万克,20-22°C,10分钟)。µl IEF前100 iodoacetamide(500毫米)和混合著增加室温(20-22°C)2小时。2-DGE。摘要为了分离酸性,相当于2-DGE蛋白质的细胞蛋白提取0重量75毫克干电池溶解在150µl修改2-DGE-solubilizing前,在解决cup-loading0-5提出了窄(pH四45-5 0,5-6五5条(7)肺Amersham生物),pre-swoll

12、en以350µl相同的修改2-DGE-solubilizing解决方案。为基本的细胞内蛋白质、肺条(pH 6-11;Amersham)第pre-swollen生物改性2-DGE-solubilizing溶液,但没有ASB-14含10%(v / v)异丙胺。细胞蛋白提取相当于1毫克的重量都那么cup-loaded干电池上肺隔间。这个修改在2-DGE分辨率的基本的蛋白质。蛋白质都集中使用Multiphor II电泳系统(Amersham 20°C的生物)。蛋白质都集中在提出了窄肺条共5 kVh 1417小时(100个V,紧随其后的是300伏特为6小时为2小时,1000 V 2小

13、时,2500 V,3500 V 2小时和5000 V 25小时),在broad-range肺条共79kVh 8(100 V 2小时,其次是300伏特2小时为2小时,1000 V 2小时,2500五12小时,3500 V和5000 V为6小时)。之后在第二层面分离10-18 % T梯度sds - page,发胶沾满Sypro红宝石的图像分析,然后' ' Coomassie双染兰色CBB G-250切除后,对现场和群众的光谱分析胰蛋白酶解方法(林。高水平的重现性Sypro斑点的蛋白凝胶Ruby-stained 2-DGE之间的样本数据相同的增长pH值(未显示)。体积密度、微分表达式

14、。/(德)值(任意单元),每Sypro Ruby-stained测定蛋白质现场运用软件包z3(电脑基因公司合作)。在这项研究中,主要的误差与此相关联的形式重现的量化是2-DGE显示自己,从生物变异是藉由使用一种chemostat对文化的细菌。那是2-DGE误差的主要来源是比较德取值25随机选择的蛋白质的斑点,选自2-DGE显示在broad-range肺分离(pH 4条0-70)。从三份样本点等效蛋白的重复不断的文化进行了综合分析。数据证实2-DGE误差的主要来源确定值。德作为一种结果,从细胞生长实验样品一各pH被用于所有2-DGE分析,提高水平的表达的蛋白质的斑点是基于变化意味着德的价值。蛋白

15、质的种类。术语“碘的在这里用来描述了多个带电的形式存在于一种蛋白质,2-DGE凝胶,那里的平均观察每个表格计算先生第二次(sds - page)尺寸小于或等于背离,由5%;那里没有证据peptide-mass映射的任何形式的截断或退化。质谱。胰in-gel消化,浓度和盐的low-copy-number蛋白质,matrix-assisted激光解析电离飞行时间(MALDI-TOF)进行大规模光谱分析(如蛋白质斑点)在被差异和独特的表达pH值为0或pH五70,或者形成部分代谢途径的兴趣(林等,2003年)。大众光谱分析蛋白质的斑点的复制2-DGE凝胶,在增长,是用来确定小灵通”身份的蛋白质,已经由

16、z3软件。蛋白质的识别。(PMM肽大众映射进行分析,如蛋白质,利用六contigs UA159基因组的s . mutans下载,2001年10月6日,被翻译成六阅读框架(林等,2003年)。原来的6 contigs以这种方式被用于一些基因鉴定在这些contigs不在场的最终版本。注释氨基酸的分析。游离氨基酸的含量在花中进行了分析与6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl pre-column derivatization氨基甲酸、使用水AccQFluor试剂工具包(科恩和Michaud,1993,科恩和DeAntonis,1994年6月初版。分离氨基酸衍生物糠

17、醛浓度和老化时间之间相(C18),用高效液相色谱柱(15 cmx3水AccQTag9毫米身分证。),根据制造商的协议(科恩,2001)。高效液相色谱法和水域进行分离模块,2695联盟474荧光检测器和2487分光光度计读数(吸光探测器,在双重l系列。控制和分析软件模块的水使专业。分析了紫外分光光度法检测胺,和所有其它氨基酸荧光检测。代谢产物的分析。葡萄糖浓度、醋酸、乙醇、酸、乳酸出现在媒体enzymically在稳态测量与相应的检测组件(罗氏),按照制造商的说明(Harty &·汉德里,1988)。这个量的积累细胞内多糖(IPS)测定方法的DiPersio碘液钾等。(1974

18、年)。结合起来的一种技术,提出了窄肺continuous-culture稳态检测,带允许Sypro Ruby-stained 2-DGE凝胶为155点的差异表达细胞蛋白调节超过1acid-tolerant增长5 . mutans期间在pH 50。其中,123用MALDI-TOF分析和53发现伴随的监管和/或stress-responsive通路(林等,2004年)。其余70蛋白质的斑点;多数伴随代谢与醣酸的生产和branched-chain、氨基酸的合成(表1)。表1。微分表达式的代谢蛋白质mutans .在pH 7五0或pH值为0葡萄糖摄取与质子的挤压在pH 70、糖的优先mutans酶II

19、的磷酸:葡萄糖phosphotransferase high-affinity PEP-PTS系统),能够清除葡萄糖分子(Ellwood等,1979年)。两个这样的系统中存在的mutans:EIIman .已经清楚,EIIglc,主要是基于生理观察(Vadeboncoeur(1984年),Neron & Vadeboncoeur,1987年)。然而,continuous-culture .研究表明,mutans十分缺乏EIIman活动,EIIglc0(Vadeboncoeur pH值五等,1991)。在这种酸pH、细菌优先采用non-PTS葡萄糖permease系统(汉密尔顿和圣马丁(

20、1982年),美国Dashper和雷诺,1990;黑&汉密尔顿,1994年),同时保持了更多的碱性细胞质增加其proton-translocating F1F0-ATPase水平及黑,1991(汉密尔顿,Cvitkovitch等,1995)。最近的诠释,然而,mutans .基因组的基因编码不确定某一特定的葡萄糖permease(Ajdi等,2002年)。分析了MALDI-TOF任何内在膜蛋白与葡萄糖摄取mutans位点。故障检测的内在疏水膜蛋白质变性革兰氏阳性菌是一种常见的蛋白质组分析问题和2-DGE林等,2003年)。尽管这个局限性,有两种形式的胞质组成,EIIABman(ManL

21、)的EIIman PEP-PTS、鉴定(图1,表1)。不幸的是,这两种形式的16 060±80,先生,14 940±30 pI 42005和44±零4特、46±0(6)分别是C-terminally删节。他们代表只有EIIA部分的蛋白质,自从肽大众指纹覆盖度局限于EIIA地区(数据未显示)。虽然EIIABman组成的EIIman PEP-PTS已经报道constitutively表达mutans(Vadeboncoeur,1984 . .),截断性质的蛋白质,本研究中观察到的严重地限制的解释可以观察到6这些蛋白在八重的pH值五0。这种限制应用的问题,可以

22、减少是否反映了在使用的葡萄糖PEP-PTS在这些酸性环境下(图1,表1)。图1。在细胞生长比较表达式,在pH 70 0或5 . mutans的蛋白质参与葡萄糖的运输和糖酵解作用。列在椭圆代表相对平均德(单位)为每个蛋白任意点2-DGE鉴定。德值大于10万名以一个高度。在pH值五0上调,蛋白质的斑点(绿色),下调(红色)、non-differentially表达(< 1差异、灰色、5或独特的表现(蓝色),相对于7pH值为0。不能被膜蛋白质中显示的是蛋白质组分析浅蓝色的矩形。括号中的数字对应蛋白质的数量在表1;superscripts确认为N-terminal蛋白质(a)和(b)C-term

23、inal碎片。相反,葡萄糖(Glk),要求为ATP-dependent磷酸化的任何自由葡萄糖进入细胞的方式,是一permease 21-fold上调,pH值五0。然而,他是最佳的葡萄糖约8波特等,0(1982年),其相对的活性和稳定性的影响在酸化胞浆酸碱度的增长,在五0内部pH值小于6雷诺兹(5 Dashper经济学博士(1990年);和汉密尔顿,1990;Iwami等,1992)。从优化pH为糖酵解作用似乎是7雷诺兹Dashper & 0(1992),降低胞质pH最可能解释为什么葡萄糖的特征是糖酵解过程中细胞生长时都resuspended 7pH值在低pH值0(Iwami &

24、山体外揽入怀中。观察增加蛋白质可能因此仅仅是反映出一个需要克服这种抑制细胞生长在pH值五0。在研究的aciduricity mutans葡萄球菌,proton-translocating F1F0-ATPase突,H +问题受到越来越多的关注,因为链球菌细胞质膜proton-permeable(酒会等,1986年)。7增加AtpA(5)和3 6-fold基在(AtpC)的这一复杂的F1-component在pH值五0(图1,表1)。这个观察结果符合之前的数据显示、atp酶水平增加了H . mutans回应的酸化环境为了保持膜pH值梯度(pH),与内地的细胞更碱(一次,1991,汉密尔顿、侯爵,

25、1991年和黑Dashper和雷诺,1992;Quivey等,2001年)。糖酵解作用葡萄糖进入细胞,由PEP-PTS或permease /活性途径,进入Embden-Meyerhof-Parnas无氧乳酸路径作为葡萄糖- 6 -磷酸和转化为丙酮酸。每个酶在这条路的不同数目的斑点2-DGE蛋白凝胶中(图1,表1)。先前的代谢中间体形成分析在上半场的Embden-Meyerhof-Parnas路径显示水平的葡萄糖- 6 -磷酸是轻微升高时mutans .生长在连续的文化、pH值五15 h-1 D = 0的水平,而其他所有中间体基本上是相同的,以及包括二羟基丙酮磷酸盐和glyceraldehyde

26、磷酸甘油酸(Iwami等,1992)。在此基础上,对glucose-6-phosphate异构酶(Gpi翻)和全面提高15的水平,6-bisphosphate fructose-1的三个异型aldolase(功能性),类似于批量以前观测到文化,2002;威尔金斯图1,表1),可能反映了一个需要克服的影响,对土壤酶活性的细胞质酸化的pH值五0。一些照顾应在这样一个简化的解释,但是,3 - 6 -磷酸果糖和glyceraldehyde可能需要为基质摘要转酮醇酶(Tkt),以增加核糖核酸合成在pH值五0(见下文)不仅是能量的形式,但ATP生成糖酵解过程中对合成代谢反应也前兆。例如,具有特定NADP-

27、dependent mutans glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GapN),第一步的类似的糖酵解过程以产生的生物还原反应NADPH要求(布朗Wittenberger,1971a乌鸦和Wittenberger;1979年;白义德等,1995,图1)。这种酶是必要的,因为mutans .既具有氧化的部分也transhydrogenase磷酸戊周期为减少由NADH NADP间,1971b Wittenberger(布朗)。二0 - 3性滴定终点可以4倍增长意味着数量的两种蛋白的NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶在pH

28、值为0,随着5水平的变化的NAD-dependent异型glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GapDH)和phosphoglycerate激酶(Pgk),突出困难的决定的碳通过两个分支路径(图1,表1)。然而,自从27-fold全面提高NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶在pH值五0代表近两倍的增长水平不同的累计其他两种酶在选择氧化分公司,这表明NADP-dependent醣glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶可能确实是最重要的决定。这将会一直保持在高水平的合成代谢活动,必须保持结构完整性的分子,

29、如蛋白质和DNA中酸性胞型(乌鸦和Wittenberger,1979年,Quivey等,2001;莱恩。这个概念已被检测的高水平及(Tkt)完全2-DGE凝胶在pH值五0。摘要转酮醇酶形成一个连接在无氧乳酸路径,将glyceraldehyde 3 - 6 -磷酸果糖、磷酸戊进入通道、核酸合成(图1,表1)。三种酶参与最终转化率的3-phosphoglycerate为丙酮酸。第一种,phosphoglyceromutase,均由6个等位基因在了mutans基因组Ajdi等,2002年)。两种蛋白产品的检测PmgY),(2 7-fold上调,pH值五0,而其他(Pgm)缺席这个pH值(图1,表1)

30、。这四个异型最终的无氧乳酸酶、丙酮酸激酶(Pyk),也都在pH值五0上调2 4 - 7 - 1、23 - 7八重。丙酮酸激酶,被认为是关键特征的糖酵解作用位点mutans,因为它是由葡萄糖- 6 -磷酸但抑制无机磷酸盐(1969及Carlsson,1975b;阿贝、山(1982年),美国Iwami &山,1980年)。然而,93%的主导形式还原酶在Embden-Meyerhof-Parnas之前,enolase无氧乳酸路径,随着(Eno)的其他小high-Mr下降和截断形式,预计会有显著影响;碳流动pH 50,特别是对enolase活动是优化pH值7Bunick & Kashe

31、t 5年。作为mutans .生长在连续的文化是缺乏适度的葡萄糖PEP-PTS活动在pH值0(Vadeboncoeur 51991)等,磷酸不需要发起了对该葡萄糖摄取蛋白质磷酸化级系统。这个级别的最后三种酶糖酵解过程中在pH值五0是一致的,降低了磷酸以来的水平降低enolase,联同一个整体2八重增加的丙酮酸激酶,四个异型预计要转换2-phosphoglycerate没有任何累积到丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸。这个想法是由测量中的四个中间体,3-phosphoglycerate,2-phosphoglycerate、磷酸和丙酮酸,s . mutans生长、pH值五15 h-1 D = 0,3-phos

32、phoglycerate水平降低,磷酸,2-phosphoglycerate仍然和丙酮酸增加(Iwami等,1992)。这是支持,另一项研究中,在细胞内的pH值下降了,能够显著提高比率(Iwami磷酸烯醇丙酮酸:山,1980年)和。也是一种乙酰胆碱酯酶抑制剂,磷酸烯醇脱氢酶(1969及Carlsson L-lactate山,1975b,1987年);水平很低,所以这种代谢产物浓度增高可乳酸累积在pH值为0,5果真如此(表2,见下文)。表2。生长的影响对产量和钢板mutans位点的代谢数字代表的意思至少三个判断。YATP决意根据假设的Harty &·汉德里(1988)。精简的再

33、生mutans位点、丙酮酸可以转化为各种各样的酸性终端产品(图2)。在有氧环境,采用丙酮酸脱氢酶mutans转换丙酮酸对acetyl-CoA(Carlsson等,1985)。尽管这种酶活动应在厌氧条件下的生长在这项研究中,其中的两种成分的饲料acetoin复杂、丙酮酸脱氢酶(AcoB组件、脱氢酶机械厂),并在C-terminal片段的dihydrolipoamide S-acetyltransferase(AdhC)、鉴定2-DGE凝胶(图2、表1)。图2。在细胞生长比较表达式,在pH 70 0或5 . mutans的蛋白质参与NADH氧化和其他用途的葡萄糖- 6 -磷酸。列在椭圆代表相对平均

34、德(单位)为每个蛋白任意点2-DGE鉴定。在pH值五0上调,蛋白质的斑点(绿色),下调(红色)、non-differentially表达(< 1差异、灰色、5或独特的表现(蓝色),相对于7pH值为0。不能被膜蛋白质中显示的是蛋白质组分析浅蓝色的矩形,而那些棕褐色椭圆确定以前,(林等,2003年)。括号中的数字对应蛋白质的数量在表1;superscripts确认为N-terminal蛋白质(a)和(b)C-terminal碎片。在厌氧条件下的多余的葡萄糖、l -乳酸是由L-lactate脱氢酶(2003)。对L-lactate减少丙酮酸,NADH反应NAD和原先的细胞是平衡的保存。然而,在

35、厌氧条件下,当血糖是限制,细菌的丙酮酸formate-lyase路径依赖,有两个分支,要么的形成和酯或酸形成的乙醇(Carlsson &格里菲斯,1974年,山田及Carlsson,1975b;山,1987年)。乙醇分支包括两个步骤,其中2 NADH被氧化,2)。mutans位点,这两个步骤,其中acetyl-CoA首先转换为乙醛酒精,然后由bifunctional酶催化、alcohol-acetaldehyde脱氢酶(AdhE)。在醋酸分公司的路径,额外的ATP生成,acetyl-CoA首先转换成乙酰磷酸盐,然后,伴随着乙酸转换到ATP ADP。通过适当的使用醋酸乙烯和乙醇的分支机构

36、,pyruvate-formate lyase路径,可以很容易地调整mutans NADH氧化的实际需要。没有进一步合成代谢的最终产品的生产,由糖酵解作用相当于甲酸酯的总量和酒精。蛋白质组分析表明这两个种类的L-lactate脱氢酶探测到2-DGE凝胶在pH值五0上调2 - 1五7-fold的水平相比,在pH 70。这些价值观相近的报告7-fold总1观察2-DGE增加为三种蛋白凝胶的mutans L-lactate脱氢酶位点和5个位点oralis异型时不使用酸度控制在批量文化等,2001,威尔金斯)。增加L-lactate脱氢酶蛋白在我们的研究中观察到的是不大可能占127-fold提高酸性条

37、件下产生l -乳酸(表2),尽管这是事实,L-lactate脱氢酶具有广阔的最佳催化活性的酸性pH范围0-6五2相似的酸碱度范围0-6六5胞细胞生长在pH值五雷诺兹,Dashper & 0(1990;汉密尔顿,1990;Iwami等,1992)。更有可能的解释是,这种酶是由无氧乳酸合成中间体在低pH值(1969及Carlsson增长,1975b;高桥等,1982年,山田,1987年)。虽然没有改变的表达formate-lyase丙酮酸的研究现状进行了观察,因为这种酶不能被探测到请2-DGE凝胶上(图2、表1),6个种类的alcohol-acetaldehyde脱氢酶,平均下调70-fo

38、ld 0时在pH 5的众多C-terminal截断形式或下调或丢失在这个pH值。AckA激酶乙酸酯分公司),是由一个因素也下调1 . 2相反,phosphotransacetylase水平增加17-fold在pH值五0(家长会。图2,表1)。尽管总的减少蛋白质表达观察2-DGE凝胶在这两个分支的丙酮酸formate-lyase途径、甲酸量的增加,醋酸、乙醇生产,pH值五0的水平6-fold乙醇作为4比0 - 7pH值(表2)。这个观察可以解释主要由增加率(汉密尔顿,无氧乳酸1984年)需要ATP为H +挤压在pH值五0(酒会等,1986年,一次,1991,汉密尔顿、侯爵,1991年和黑Miya

39、gi等,1994年,史密斯等,1996)。事实上,有一个无用的使用碳pH值五0是反映在ATP产量减少测量,(YATP;Harty &·汉德里,1988)从16九9到3号)的细胞(干重、细胞组分ATP产量(YGlc),从0到1528日1克(干重)细胞组分的增长,当血糖降低pH值是0到5 70(表2)。虽然显然不可能阻止生产替代酸,问题是是否在酶水平下降的乙醇和醋酸分支路径限制在formate-lyase丙酮酸细胞生长成为在pH值为0,以及5这样提高流动的丙酮酸脱氢酶通路通过L-lactate。branched-chain氨基酸的形成减少酸(醋酸+乙醇)的比值,从理论最大值1无氧

40、乳酸值0 - 0的值56人死亡,在pH值五0(表2)。款式鞋子都是相同的,在小灵通降低pH值五0酸,表明了这mutans .进一步代谢酸。可供选择的场景,增加生产乙醇的过程中,由另一个降解将缺席,因为乙醇只能通过丙酮酸formate-lyase形成的通道。比较蛋白质组分析显示的命运,有些酸在pH值五branched-chain 0与氨基酸的合成途径,因为增加患病酶与此相关联的氨基酸路径独自在pH值五0(图3和表1)。连接,自从异亮氨酸生物2-oxobutanoate要求,并在deamidation丝氨酸的lyase铵(IlvA由苏,EC .19)。丝氨酸是由one-carbon甲酸的捐赠者的周

41、期。两者的合成及缬氨酸亮氨酸;另一方面,直接在丙酮酸(图3)。但是最后,branched-chain氨基酸生物都需要和NADPH丙酮酸的合成异亮氨酸和亮氨酸,缬氨酸。新生合成的氨基酸会减少酸生产两种方式,直接通过消除减少等价物的丙酮酸和2-oxobutanoate和间接的消费NADPH(图3)。再者,降低水平的酸也降低了,自从H +浓度甲酸是一种强酸性(pKa 75)比3乳酸(pKa 86)或三乙酸(pKa 475)。图3。在细胞生长比较表达式,在pH 70 0或5 . mutans蛋白质的氨基酸生物branched-chain参与。列在椭圆代表相对平均德(单位)为每个蛋白任意点2-DGE鉴定

42、。蛋白质的斑点,pH值五0上调(绿色)、下调7在pH值0(红色)。通过蛋白质组分析蛋白质不确定中显示的是淡蓝色的矩形。括号中的数字对应蛋白质的数量在表1。在pH值五0,对ketol-acid异型reductoisomerase(4)3IlvC上调,5 - 7 - 25 - 6和3个,而branched-chain氨基酸是轻度转氨酶升高(IlvE卷(GlnA)和谷氨酰胺)上调7 - 8 2,分别7-fold(图3,表1)。这个产品的branched-chain氨基酸是轻度转氨酶升高,2-oxoglutaric酸(-ketoglutaric酸),也是一种弱酸性比麸胺酸值,pKa五8二0,与之相比,

43、pKa值22和42羧基组谷氨酸。所形成的branched-chain氨基酸会有额外的优势,因为所有的三种氨基酸的合成的形成所涉及谷氨酰胺添加氨。这种氨,随着生产期间,从丝氨酸合成异亮氨酸,将提供另一种机制为缓冲酸性胞浆mutans位点在增长的五pH值为0,自从NH3会有什么样的反应和H +形成(图3)。有趣的是,丙酮酸激酶活性有义不容辞的要求,要么K +或者高浓度的似乎并不是有害的增长(阿贝、山口腔链球菌(1982年),美国,1987;Pitty山和雅克,1989年9月初版。支持的branched-chain氨基酸生物的生存在低pH值来源于链球菌2最近的观测。在branched-chain链球

44、菌、氨基酸生物合成途径是必要的,但并不足以保证最佳的增长,以及作用已假定为途径,在维护内部pH值(Garault等,2000年)。通过Differential-display也证实branched-chain胺基酸酶是由酸性条件下上调,研究mutans . ilvC导致延迟生长在pH值五5(嘉等,2001年)。进一步支持一个角色,branched-chain氨基酸的合成维护内部pH来自于,2-acetolactate由丙酮酸合成的酶(AlsS由acetolactate,EC .6)发生的交界处,acetoin亮氨酸的生物合成途径/缬氨酸。生物的acetoin导致双乙酰形成(图2)。虽然只有最后

45、的酶在这条路的,acetoin脱氢酶(而是达到目的),是不屈不挠,2-DGE鉴定的酶在pH值五0只有3%的pH值,在70(表1),显示大部分的2-acetolactate已经指向亮氨酸/缬氨酸合成途径。尽管蛋白质组的数据,并进行分析与乙醇酸,必须符合产品的形成,branched-chain氨基酸的氨基酸在continuous-culture中只有2%高于5比pH值0 - 0(pH值7数据未显示)。不像其它氨基酸的交通系统中,branched-chain . mutans氨基酸吸收已被彻底研究过的,已经被证明是受到了proton-motive力,从而导致细胞内branched-chain氨基酸水

46、平较高Dashper &雷诺兹(,1990)。失去这些氨基酸的细胞是由于被动射流通过细胞膜(Dashper和雷诺,1990)。作为残余的细胞浓度不同的branched-chain氨基酸约3毫米,0稳态连续的文化、细胞浓度会高达10毫米(Dashper和雷诺,1990)。作为一种结果,提高细胞合成的氨基酸,pH值五0未必反映了细胞的增加。另外,值得注意的是,分析表明,24使用4 %的氨基酸在蛋白质的氨基酸都branched-chain mutans s,这意味着有很高的生物合成要求这些氨基酸在蛋白质的合成。在其他的生物合成途径变化在这个水平的变化表现个人蛋白质,代表完整的代谢途径,也2-DGE鉴定。第一种是与利用葡萄糖1-phosphate,转换成葡萄糖- 6 -磷酸通过phosphoglucomutase(PgmA)。一个C-terminally截断形式的这种酶被发现在pH 70(图2、表1)。1-ph