JNK在惊厥持续状态幼年大鼠海马中的表达及依达拉奉对其的影响

1、JNK在惊厥持续状态幼年大鼠海马中的表达及依达拉奉对其的影响                     作者：陆海燕，邓小龙，李光乾，李伟【摘要】  目的 ：研究(JNK)在惊厥持续状态(SC)幼年大鼠海马中的表达及依达拉奉对其的影响。方法：雄性SD幼年大鼠120只分为正常对照组(NC组)、惊厥持续状态组(SC组)、依达拉奉组(EDA组)三大组;各大组均随机分为5组，分别于惊厥后4、12、

2、24、48和72 h处死。采用氯化锂-匹鲁卡品法制作惊厥持续状态模型。EDA组在大鼠造模前三天予EDA腹腔注射，每天注射一次，连续3 d。TUNEL法检测观察大鼠海马细胞凋亡情况;免疫组化法检测海马p-JNK蛋白表达动态变化;RT-PCR技术检测海马JNK1 mRNA表达的动态变化。结果：SC组在惊厥12 h后的各时间点海马CA1区TUNEL阳性细胞数均显著高于NC组(P<0.01)，而ED组TUNEL阳性细胞数均较SC组显著下降(P <0.01或P <0.05)。幼年大鼠海马CA1区p-JNK蛋白在SC组表达显著增强，与NC组比较差异有显著性(P <0.01)，在ED

3、A组表达较SC组明显下降(P <0.01)。SC组海马JNK1 mRNA表达明显高于NC组(P <0.01)，而在EDA组JNK1 mRNA的表达较SC组显著降低(P <0.01)。结论：SC可诱导JNK的表达，促进SC后海马神经元凋亡;EDA预处理可以影响JNK的表达，减轻惊厥后海马神经元凋亡程度。 【关键词】  惊厥;脑损伤;幼年大鼠;JNK;依达拉奉Abstract: Objective: To observe the change of JNK in the hippocampus of status convulsive rat and the regul

4、ation effect of EDA on it. Methods: One hundred and twenty male Juvenile Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into normal control group (NC)， status convulsivus group (SC)， and edaravone group (EDA);and every group were randomly divided into five groups， which would be executed at 4 h，12 h，2

5、4 h，48 h and 72 h after convulsion discontinued. Status convulsivus (SC)was induced by injecting Lithium Chloride and Pilocarpine. Group EDA were injected EDA before convulsion，and repeatedly every day for 3 days. The expression of apoptosis cells were observed with TdT-mediated dUTP nick end labeli

6、ng (TUNEL)，the changes of p-JNK protein in the hippocampus CA1 domains were detected with immunohistochemistry(IHC)，the expression of JNK1 mRNA were detected with RT-PCR. Results: The TUNEL positive cells in hippocampus CA1 of SC group were more than that of NC group at 12 h after the SC(P <0.01)

7、. After the intervention of edaravone，TUNEL positive cells showed a significant drop (P <0.01 or P <0.05). The expression of p-JNK protein in the hippocampus CA1 domains increased markedly in SC group. The difference was statisticaly significance compared with NC group (P <0.01)， and EDA gr

8、oup was much lower than SC group (P <0.01). The expression of JNK1 mRNA in the hippocampus in SC Group was much higher than NC Group (P <0.01)，and EDA group was significantly lower than SC group(P <0.01). Conclusion: SC maybe increase the expression of JNK， JNK may be mediated to cell apopt

9、osis. EDA can effect the expression of JNK， and lessen the pothology of hippocampus.Key words: convulsion;brain injury;juvenile rat;JNK;edaravone惊厥是小儿时期较常见的急症。当惊厥反复发作而未能很好控制时，可导致进行性脑损伤，并可造成认知损害1。多种因素导致神经元坏死和细胞凋亡是惊厥性脑损伤的基本原因。JNK(C-Jun N端激酶)是凋亡途径中重要的信号分子，已有部分学者对其参与神经元凋亡的情况做了研究。然而在惊厥持续状态(status convuls

10、ive，SC)后的表达情况目前尚未见相关报道。依达拉奉(edaravone，EDA)对低氧缺血性脑病的神经元保护作用已得到证实2，但其对于SC后JNK的表达及神经元凋亡的影响情况，国内外尚未见报道。本实验通过建立氯化锂-匹鲁卡品SC大鼠模型，观察幼年大鼠海马p-JNK蛋白及JNK1 mRNA表达的变化，及依达拉奉对SC后海马JNK表达及神经元凋亡情况的影响，初步探讨JNK与惊厥性脑损伤的关系及依达拉奉在SC幼鼠中可能的神经元保护机制。1 材料和方法1.1 实验动物和试剂 清洁级健康幼年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(购自中国科学院上海分院试验动物中心)120只，体重5070 g。

11、氯化锂、匹罗卡品购自美国Fluka公司，细胞凋亡检测试剂盒购自美国罗氏公司。鼠抗p-JNK单克隆抗体购自美国Stancru公司。M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，依达拉奉由南京先声东元制药有限公司资助。1.2 实验分组和SC动物模型的建立 随机将SD大鼠分为正常对照组(NC组)、惊厥持续状态组(SC组)、依达拉奉组(EDA组)三大组，每组40只大鼠;各大组再随机分为5小组，分别于惊厥后4、12、24、48和72 h处死。若因模型不成功、死亡造成各亚组样本量不足8只的，按随机原则补足。采用氯化锂-匹鲁卡品法制作SC模型。SC模型制作参照胡越等3方法。惊厥按

12、Racine分级标准分为V级，惊厥发作达到IV-V级，持续时间至少30 min，惊厥解除后状态良好的大鼠为合格SC大鼠模型。NC组：不作任何处理。EDA组：造模前3 d予EDA 3 mg/kg腹腔注射，每天注射一次，连续3 d，其余用药同SC组。1.3 动物标本的制备 大鼠分别于惊厥后各时间点处死。经10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉后，断头剥离颅骨，完整取出脑组织置于冰盘上，分离右侧海马脑组织，放入去RNA酶的EP管中，迅速置于液氮中保存。左侧大脑在垂直视交叉处离断，并冠状位向后切取约5 mm，放入预冷的4%多聚甲醛固定12 h，入70%乙醇，送病理科进行石蜡包埋;石蜡包埋后制片，

13、切片厚度为5m。1.4 实验方法1.5 统计学处理方法 多组比较采用单因素方差分析，均数的两两比较采用LSD-t检验，两变量的相关采用直线相关分析法分析。2 结果2.1 各组大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞表达结果(见图1) TUNEL结果显示，TUNEL阳性细胞主要在神经元及神经胶质细胞，胞核中出现棕黄色颗粒，形成典型的“指环状”或“半月状”的细胞凋亡特征。SC组海马CA1区TUNEL阳性细胞于惊厥后4 h已有少量表达，48 h达高峰，之后有下降趋势;其24、48、72 h三个时间点均明显高于NC组(P <0.01)。EDA组24、48和72 h时间点TUNEL阳性细胞表达水平较SC

14、组均明显降低(P <0.01);但仍高于NC组(P <0.01)(见表2)。2.2 大鼠海马p-JNK蛋白免疫组化结果(见图2) 免疫组化结果显示，NC组p-JNK蛋白在神经元和神经胶质细胞的胞核少量表达。SC后4 h海马CA1区p-JNK蛋白表达即开始增加，48 h达高峰，72 h下降。而EDA组惊厥后各时间点海马p-JNK蛋白表达水平较SC组降低，以24和48 h时间点为著(P <0.01)(见表3)。2.3 各组大鼠海马JNK1 mRNA的表达(见图3) RT-PCR方法检测到NC组大鼠海马JNK1 mRNA少量表达。SC组JNK1 mRNA的表达于惊厥后4 h开始增加，48 h达高峰，72 h下降。而EDA组惊厥后24和48 h时间点海马JNK1 mRNA表达水平较SC组均明显降低(P <0.01)(见表4)。2.4 相关性分析 大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞与CA1区p-JNK蛋白表达呈正相关(=0.567，n=80，P<0.01)。海马CA1区TUNEL阳性细胞与JNK1 mRNA表达正