稀土荧光探针检测多巴胺及类似物.

1、稀土荧光探针检测稀土荧光探针检测多巴胺及类似物多巴胺及类似物答辩人：袁洁导师：赵美萍 副教授2003年6月18日n选题背景n已有检测方法综述n实验部分n总结n致谢儿茶酚胺的结构 及生理意义n儿茶酚胺（catecholamine, CA）的种类、结构和生理意义n神经递质在单细胞检测中的意义Dopamine（DA）n瑞典神经药理学家Carlsson于1958年首次提出脑内多巴胺(DA)是独立的神经递质 n正常值范围为血浆：888pmol/L； 尿：424-2612nmo1/24h。n增高会引起嗜铬细胞瘤，心肌梗塞，糖尿病酮症酸中毒等一系列疾病。而其含量的降低会引起植物神经病变，帕金森病等。 Epi

2、nephrine（E）& nor epinephrine （NE） 在人体内的正常值 范围为 血浆：480pmo1/L； 尿：0-80nmo1/24hl在人体内的正常值范围为血浆：615-3240pmol/L； 尿：0-590 nmol/24h对儿茶酚胺的检测手段对儿茶酚胺的检测手段检测方法灵敏度优点缺点放射酶学法放射酶学法2.210 -1 0 M ,灵敏度高 ，选择性好技术难度高 ，检测速度慢，危险 HPLC法法 depends分离效果好 ，可结合不同检测器应用流动相有可能影响检测效果荧光测定法荧光测定法(THI(THI、EDA) EDA) 10 10M-10 9 M（改良后）常规使

3、用，改良后灵敏度较高样品处理程序复杂，特异性不高 电化学分析电化学分析法法 10 6M-10 5 M能排除抗坏血酸的影响，重现性较好 灵敏度低,只是针对DA检测,仍处于实验研究阶段 毛细管电泳毛细管电泳（CE）法）法 10-8 M（depends）分离高效,耗样量少 灵敏度尚不高稀土荧光探稀土荧光探针法针法10-8 M简便，可以与各种分离手段联用灵敏度不够高稀土荧光探针检测稀土荧光探针检测儿茶酚类化合物的原理儿茶酚类化合物的原理 单纯的TbCl3，Tb-DCTA体系和DOPAC在实验用的波长条件下(298nm,546.8nm)都没有荧光信号，可见体系发光是由于形成了Tb-DCTADOPAC三重

4、络合物并发生了能量转移得结果。DOPAC的荧光图的荧光图红：激发波长为279nm蓝：激发波长为298nmTbCl3的荧光图的荧光图红：激发波长为298nm蓝：激发波长为240nmTbDCTA荧光图荧光图玫红：激发波长为240nm绿：激发波长为240nm（三重络合物，TbDCTA浓度同上）绿：激发波长为298nmTbDCTADOPAC体系荧光图体系荧光图绿：激发波长为240nm红：激发波长为279nm蓝：激发波长为298nm1.三元络合物的形成三元络合物的形成 三元络合物体系：三元络合物体系：1.离子缔合三元络合物 2.金属离子先后结合两种配体形成三元络合物 TbDCTACAs体系：体系：Tb与

5、DCTA先行络合，然后Tb余下的空位再与CAs络合，形成三重络合体系 2.三元络合物发光机理三元络合物发光机理(1) 配体受激后,单重态（S1）有三种方式退激： a. 产生荧光的辐射跃迁(S1-S0) b. 系间窜跃(S1-T1) c. 无辐射跃迁回基态(ISC) 三重态（T 1）也有三种退激方式： a. 产生磷光的辐射跃迁(T1-S0) b. 通过无辐射转移跃迁到Tb3的激发态(ET)，c. 无辐射跃迁回基态(T1S0)。2.三元络合物发光机理三元络合物发光机理(2) 分子内能量转换效率的影响因素：1.配体最低的激发三重态（T1）能量高于Tb的5D4能级的能量2.能量转移的速率大于三重态无辐

6、射退激的速率3.从配体激发单重态向三重态系间窜跃的速率和几率相当高2.三元络合物发光机理三元络合物发光机理(3)儿茶酚胺的磷光发射波长在409 nm417 nm，亦即其三重态（T1）的能量高于Tb3的5D 4能级约3800-4000 cm 1高量子产率和跃迁几率能量转移速率常数高达1010s1由水或解离的氧导致的配体三重态（T1）以及Tb3， 发光的猝灭也大大减少了。 实验条件的优化实验条件的优化稀土离子与第一配体的选择：稀土离子与第一配体的选择： 1. Eu3 + EDTA体系 ； 2. Eu3phen体系； 小结： 最终弃用这两个体系的原因，是其适用的pH范围太低，难以使DA的羟基充分解离

7、形成三元络合物。实验条件的优化实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择：稀土离子与第一配体的选择： 3. Tb3 + EDTA体系（1）： Tb:EDTA1:1（浓度均为2 mmol/L）, pH11, ex300 nm，em545 nm,加入甲醇（分析纯）、CsCl、TOPO等尝试敏化,无法得到满意 检测限，DA为105 mol/L 小结： 目前研究最多的体系，适用的pH相对于前两个体系有了很大提高，但是仍然未能达到文献报道的结果 实验条件的优化实验条件的优化稀土离子与第一配体的选择：稀土离子与第一配体的选择： 3. Tb3 + EDTA体系（2）： Tb:EDTA1:1（浓度均为2 mmo

8、l/L）, pH11, ex240 nm，em545 nm,出现递减结果小结： 在ex240 nm，em545 nm,出现的Tb3特征波长处的递减结果，可能是由于在检测条件下,TbEDTA体系能发出Tb3的特征荧光，而待测物与之形成三重络合体系后,激发波长红移，亦即三重络合体系的形成导致了一部分Tb3特征荧光的猝灭。 0.000000.000050.000100.000150.00020020406080100120140160180FluorCDA/M0.000000.000050.000100.000150.00020406080100120140160180FluorCDOPAC/MAC

9、DOPACFluro图 BCDA-Fluro图 实验条件的优化实验条件的优化稀土离子与第一配体的选择：稀土离子与第一配体的选择： 4. Tb3 + DCTA体系 ： 20C 时， Tb3与EDTA的络合常数lgK1为17.93，而与DCTA的络合常数lgK1为20.20* 因此本体系可以在更高pH下存在，更利于三重络合物形成pH影响11.011.512.012.513.04142434445464748FluorpH20304050607080280300320340360380400420440460FluorVNaOH/ul0.4 mmol/L Tb3DCTA，2105 mol/L DOP

10、AC，横坐标为pH 0.2 mmol/L Tb3DCTA，4105 mol/L DOPAC溶液（色谱纯甲醇：重蒸水9：1），横坐标为5 ml样品中10 mol/L NaOH的体积 表面活性剂的影响由于水分子对荧光有相当的猝灭作用，体系又是在水相中，因此尝试加入表面活性剂进行改进。期望荧光体系能够被包裹在表面活性剂形成的胶束中得到保护，起到敏化作用。共尝试加入了阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠，阳离子表面活性剂溴代十二烷基三甲胺和非离子表面活性剂TOPO。都未起到期望的对体系的改善作用。甲醇含量影响0.2 mmol/L Tb3DCTA，4105 mol/L DOPAC溶液 ，NaOH fixed0

11、20406080100050100150200250300350400450Fluro甲 醇含量 （）重原子影响 重原子对于荧光体系有时也可起到敏化作用。实验尝试向体系加入了SrCl2，BaCl2，以及CsCl，其中CsCl的加入对体系的荧光有明显得增强作用 ，最后选择CsCl浓度为0.1 mol/L。 0.000.020.040.060.080.1080859095100105110115120125FluroCCS+/M加样顺序影响TbDCTA， 甲醇， NaOH， CsClTbDCTA， 甲醇， CsCl， NaOHTbDCTA， NaOH，甲醇， CsClTbDCTA， NaOH， C

12、sCl，甲醇Tb，DCTA， 甲醇， NaOH， CsClDCTA， 甲醇， Tb，NaOH， CsCl实验操作 向5 ml比色管中依次加入前述Tb-DCTA溶液0.1 ml、10mo l/L NaOH溶液0.04 ml、10 mol/L CsCl溶液0.05 ml、色谱纯甲醇4.5 ml，混匀。在检测前再加入待测物，用重蒸水定容至5 ml，在激发波长为298 nm，发射波长546.8 nm处用0.5 cm比色池测定荧光强度。 实验结果 a. CDA Fluro图 b. CDOPAC- Fluro图 0.0000000.0000020.0000040.0000060.0000080501001

13、50200250FluroCDA/mol L-1 B Data1B0.0000000.0000020.0000040.0000060.000008050100150200250300350400FluroCDOPAC/mol L-1 B Data1B实验结果 c. C邻二酚 Fluro图 d. C3，4二羟基苯甲酸Fluro图 0.0000000.0000020.0000040.0000060.000008050100150200250FluroCCA/mol L1 B Data1B0.0000000.0000020.0000040.0000060.0000080100200300400500600700800FluroC3,4-二羟 基苯 甲 酸/mol L-1 B Linear Fit of Data1_B实验结果 被测物指标多巴胺（DA）3,4二羟基苯乙酸（DOPAC）邻二酚（儿茶酚）3,4二羟基苯甲酸线性范围8108 8106mol/L8108 8106mol/L 8108 8106mol/L 8108 8106mol/L 线性相关系数0.99880.99920.99670.9982检测限5.2108 mol/L3.6108 mol/L5.7108 mol/L2.97108 mol/L 1.证明了CAs