酶活力测定方法ppt课件

1、2 2酶活力测定法酶活力测定法 1 1基本原理：基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。越快所表示的酶活力越高。 酶反应速度可以用单位时间反应底物的酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。减少或产物的增加来表示。 通常酶活力测定时，先制备酶反应进程曲通常酶活力测定时，先制备酶反应进程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速度的测定，线和酶浓度曲线。通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量。求得酶的

2、浓度或含量。酶反应进程曲线酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。酶浓度曲线酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。宜。 酶活力测定的要求：测得的反应速度酶活力测定的要求：测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系，这必须和酶浓度有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、也是检验酶反应和测定系统

3、是否适宜、正确的标准。正确的标准。2 2酶促反应的条件及影响因素酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度：一般选用底物的浓度底物的浓度：一般选用底物的浓度S=100KmS=100Km。 pHpH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、 适宜的适宜的pHpH值的缓冲系统来控制值的缓冲系统来控制pHpH。 温度：酶反应的温度通常选用温度：酶反应的温度通常选用2525、3030或或 3737，实验中温度变动应控制在，实验中温度变动应控制在0.10.1以内。以内。 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。相应的辅酶。空白和对

4、照试验：空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引空白试验：是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。起的变化量，它提供的是未知因素的影响。空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者都加酶预先经过失效处理）。者都加酶预先经过失效处理）。 对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。得的结果，主要作为比较或标定的标准。 3 3测定方法：测定方法： 取样测定法：取样测定法：酶酶反反应应不不同同的的时时间间取取样样终终止止反反应应测测定定酶酶变变性性剂剂：5 5% % 三三氯

5、氯醋醋酸酸 3 3% % 高高氯氯酸酸 其其它它酸酸、碱碱、醇醇类类加加热热：使使酶酶失失效效连续测定法：在反应过程中对反应系统进连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续检测。行直接连续检测。检测方法：检测方法：紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法 旋光法旋光法荧光分光光度法荧光分光光度法 电化学测定法电化学测定法 酶偶联测定法酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。离子选择性电极测定法等。 例如：胰蛋白酶效价测定例如：胰蛋白酶效价测定胰蛋白酶胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键碱性氨基酸）肽键、酰氨键、酯键碱性氨基酸）水解速率：酯键水解速率：酯键酰氨键酰氨键肽键肽键供试品溶液：供试品溶液：

6、50506060单位单位/ml/ml底物溶液：底物溶液：N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸乙酯精氨酸乙酯 浓度：浓度：A A：0.5750.575.0585.0585N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸乙酯精氨酸乙酯 N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸精氨酸 253nm处的处的A随酶促反应递增，根据随酶促反应递增，根据酶活力单位定义计算酶活力。酶活力单位定义计算酶活力。H2N-C-NHCH2CH2CH2-CH-COOC2H5NHNH-CO-酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。单

7、位。测定：测定：空白：底物溶液空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl+ 0.001mol/L HCl 每每30s A30s A的改变：的改变：0.0150.0150.0180.018，呈线性关系的时间不得少于呈线性关系的时间不得少于3min3min。供供试试品品溶溶液液 + + 底底物物溶溶液液计计时时摇摇匀匀25.0。C+0.5。C测测定定：每每隔隔 3 30 0 s s，读读取取A A，共共 5 5 m mi in n A A每分钟改变每分钟改变0.0030.003，相当于，相当于1 1个胰蛋个胰蛋白酶单位。白酶单位。 供试液的供试液的A A每分钟改变每分钟改变A1 - A2T相

8、当于的单位数为相当于的单位数为每每mgmg供试品中含胰蛋白酶单位数为供试品中含胰蛋白酶单位数为0.003:1A1 - A2T=:XA1 - A20.003TA1 - A20.003TWP =A1A20.003 T W 重组人白细胞介素重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽的胰蛋白酶切肽图分析图分析 肽图分析是评价重组产品蛋白质结肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法构及其生产工艺稳定性的重要方法,目目前常用的方法有裂解前常用的方法有裂解-微量肽图法和胰蛋白酶切微量肽图法和胰蛋白酶切 肽图法。肽图法。 1 1。酶切条件。酶切条件 取浓度为取浓度为3 3-1-1的样品的样品0

9、40 4对对1%1%4 43 3充分透析充分透析, ,然后取透析然后取透析样品样品250250至微量进样瓶至微量进样瓶, ,加加0 30 3-1-1处理的胰蛋白酶处理的胰蛋白酶1010混匀混匀, ,于于3737温控自动进样器酶切温控自动进样器酶切, ,每每8080进进样一针样一针, ,进样量进样量66, ,用用3232色谱软件选择色谱软件选择214214进行分析进行分析, ,直直至至 1111完全酶解。按此方法摸索最完全酶解。按此方法摸索最佳酶切时间佳酶切时间, ,在第在第1414针后针后 1111已被已被完全酶切完全酶切, ,酶切时间在酶切时间在18182222范围内肽图范围内肽图图谱基本一

10、致图谱基本一致, ,即确定最佳酶切条件为即确定最佳酶切条件为3737保温保温2020。 2。系统测试。系统测试 系统测试标准物质进样后呈系统测试标准物质进样后呈3个峰个峰,12次重复进样次重复进样3个峰保留时间的个峰保留时间的分别为分别为0. 4%,0 .6%和和0. 8%,峰面积的峰面积的分别为分别为0 .7%,0 .8%和和0 .8%。 11对照品对照品37酶切酶切20后于后于4温控自温控自动进样器连续进样动进样器连续进样5次次,结果见图结果见图1。5个色个色谱图完全重叠在一起谱图完全重叠在一起,所产生所产生21个峰的保个峰的保留时间、峰高和峰面积的均分别小留时间、峰高和峰面积的均分别小于于1 .0%,5 .4%和和9. 8%,表明本系统误差小表明本系统误差小,重复性好重复性好,可用于可用于11的肽图分析。的肽图分析。 3批批 11制品的制品的 图谱图谱完全一致完全一致,说明该厂说明该厂 11的生产工艺是稳的生产工艺是稳定的定的;与公司生产的与公司生产的 11对照品比较对照品比较有有20个峰与对照品一致个峰与对照品一致,但第但第6 峰的峰高和峰面峰的峰高和峰面积均明显较小积均明显较小,且在第且在第9和第和第10 峰之间多一个峰峰之间多一个峰,说明该厂说明该厂 11蛋白质结构与公司生蛋白质结构与公司生产的产的 11比较存