鱼腥草离体再生及农杆菌介导的遗传转化

1、鱼腥草离体再生及农杆菌介导的遗传转化         11-02-25 15:31:00     编辑：studa20              作者：董燕，来慧丽，张雅明，周联，王培训【摘要】  【目的】建立鱼腥草离体再生系统和农杆菌介导的遗传转化方法。【方法】以鱼腥草叶片为外植体置于不同激素配比的MS培养基上，进行愈伤组织诱导和分化再

2、生。以根癌农杆菌EHA105/pCAMBIA13052进行转化，将外源GUS(葡萄糖醛糖苷酶)基因、潮霉素抗性基因转入鱼腥草，以组织化学染色法检测GUS活性，以聚合酶链反应(PCR)法鉴定基因组中的GUS基因。【结果】 MS培养基中添加01 mg/L 奈乙酸(NAA)、20 mg/L 6其基腺嘌呤(6BA)、05 mg/L呋喃氨基嘌呤(KT)适于鱼腥草叶片为外植体进行离体再生，出芽率达967%。潮霉素作为筛选试剂，浓度为25 mg/L;头孢霉素作为抑菌剂，浓度为250 mg/L。经感染的外植体中GUS 反应呈阳性的占750 %;8周统计抗性芽比率55%，PCR分析表明GUS基因已整合到鱼腥草基

3、因组中。【结论】通过鱼腥草离体培养条件的研究及根癌农杆菌介导的遗传转化，获得了较高的离体再生频率，实现了鱼腥草的遗传转化。 【关键词】  鱼腥草/生长和发育;离体再生;遗传转化;根癌农杆菌鱼腥草为三白草科植物蕺菜(Houttuynia cordata Thunb)的全草，是多年生的草本植物，具清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功效，在我国许多地区均有大面积人工栽培。鱼腥草生长旺盛，易于离体培养，是较好的转基因受体材料，而目前未见鱼腥草转基因报道。本研究以鱼腥草叶片为外植体，通过离体再生和农杆菌介导的基因转化建立了鱼腥草遗传转化系统，为鱼腥草种质资源优化或作为生物反应器生产药用蛋白打下基础

4、，现报道如下。1材料与方法11植物材料鱼腥草无菌苗，自广州中医药大学药圃取鱼腥草植株的茎尖，自来水冲洗10 min，用体积分数75%酒精浸泡30 s，1 g/L升汞浸泡810 min，无菌水冲洗68次，接种于MS培养基上，2528，光照14 h/d，光照度2 000 Lx，培养无菌苗。12质粒和菌株质粒pCAMBIA13052和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株均由华南农业大学刘耀光教授惠赠，根癌农杆菌工程细胞EHA105/pCAMBIA13052为本室构建。质粒pCAMBIA13052 携带葡萄糖醛糖苷酶报告基因(GUS)，具有潮霉素抗性基因(植

5、物选择标记)和卡那霉素抗性基因(细菌选择标记)。13主要试剂与仪器植物激素奈乙酸(NAA)、呋喃氨基嘌呤(KT)、6苄基腺嘌呤(6BA)和头孢霉素(cefotaxine)均购于广州威佳生物技术公司,卡那霉素(kanamycin)和羧苄青霉素(carbenicillin)为美国Sigma公司产品,氯霉素(chloramphenicol)为MEBCHEM公司产品,潮霉素(hygromycin，Hyg)为德国Roche公司产品,植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)为天根生化科技(北京)有限公司产品，500 bp DNA Ladder为宝生物(大连)有限公司产品，乙酰丁香酮(Acetosyring

6、one，AS)为美国MEBCHEM产品,5溴4氯3吲哚D葡萄糖苷酸酯(XGluc)为美国Ameresco公司产品。2720型聚合酶链反应(PCR)扩增仪为美国ABI公司产品，GDS7500凝胶成像及分析系统为英国UVP公司产品。14培养基基本培养基为MS，用于无菌苗的培养。在基本培养基中添加植物激素用于离体再生，加入一定量抗生素用于筛选培养。LB培养基用于农杆菌培养。15GUS基因转化鱼腥草取无菌苗的叶片，切下直径为5 mm的叶圆片，叶面朝上置于培养基上，避光预培养2 d。挑取EHA105/pCAMBIA13052农杆菌单菌落，接种于3 mL LB液体培养基(含17 mg/L氯霉素和100 m

7、g/L卡那霉素)中，28、200 r/min，振荡培养24h后，取1 mL菌液，接种到30 mL LB液体培养基中，振荡培养至D600为0304时，将预培养2 d后的叶圆片浸没于菌液中侵染叶片15 min，取出后置于无菌滤纸上吸去附着的菌液，置于添加100 mol/L乙酰丁香酮的MS培养基上，避光共培养2 d，转入筛选培养基上再避光培养7 d后，进行光照培养。培养温度2528，光照14 h/d，光照度2 000 Lx。16GUS活性的组织化学鉴定参照植物分子生物学实验指南2，采用GUS组织化学染色法检测葡萄糖醛糖苷酶活性。17GUS基因整合鉴定采用文献报道1的GUS基因片段的引物序列如下：上游

8、引物：5GTGGAATTGATCAGCGTTGG3;下游引物：5ATCGGCATGAACTTCGGTG3，委托上海生物工程技术有限公司合成。以植物DNA提取试剂盒提取抗性植株总DNA，以GUS 上、下游引物进行PCR鉴定：94变性5 min后进入PCR循环，即94、1 min，59、1 min，72、1 min，35个循环，72延伸7 min。2结果与分析21不同激素组合对鱼腥草离体再生的影响采用添加不同激素组合的MS培养基进行以鱼腥草叶片为外植体的离体培养(见表1)，结果显示单独添加2,4D时出愈率高，但不分化。添加NAA和6BA可诱导愈伤并出芽，而同时添加2,4D时出愈率提高，但不出芽，说明2,4D有利于愈伤组织的形成，但抑制再生出芽。在NAA、6BA组合中再添加KT可明显提高出芽率，表明KT有利于出芽。确定添加01 mg/L NAA、20 mg/L 6BA、05 mg/L KT适于鱼腥草离体再生，培养1周开始出现愈伤组织颗粒，培养3周分化出芽，待芽长至2cm左右从外植体上切下，转至MS基本培养基中诱导生根(图1)。表1激素对鱼腥草离体再生的影响22筛选培养中潮霉素浓度确定质粒pCAMBIA13052上有潮霉素(Hyg)抗性植物选择标记。取鱼腥草切下的叶圆片在Hyg浓度分别为0、25、50、75 mg/L的筛选培养基上培养5周，观察愈伤组织芽分化的