脑络欣通对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经上皮干细胞蛋白巢蛋白表达的影响

1、脑络欣通对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经上皮干细胞蛋白巢蛋白表达的影响         11-05-09 09:40:00     编辑：studa20                      作者：陈业农,王键,唐巍,胡建鹏  【摘要】 

2、目的 观察益气活血治法代表中药复方脑络欣通及其拆方(益气方、活血方)对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠室下区(SVZ)神经干细胞增殖的影响。方法 采用线栓大脑中动脉法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,分别观察益气活血、益气、活血3种治法及其代表方药在缺血2 h后,分别再灌注1、3、7 d的治疗效果；免疫组化染色SABC法检测神经上皮干细胞蛋白巢蛋白表达。结果 各治疗组巢蛋白表达增加,但仅在缺血再灌注7 d时与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；益气活血法组表达明显增加,在缺血再灌注7 d时与益气法组和活血法组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 经过脑络欣通(益气活血法)及其

3、拆方(益气方、活血方)干预后,可使内源性神经干细胞的增殖明显增加,脑络欣通在促进神经干细胞增殖(7 d)表达的效应上要优于其拆方(益气方、活血方)。 【关键词】  脑络欣通；局灶脑缺血再灌注；神经干细胞；巢蛋白增殖    Key words：Naoluoxintong；local cerebral ischemia-reperfusion；neural stem cells；Nestin proliferation     本实验选用局灶性脑缺血再灌注模型大鼠,观察脑络欣通及其拆方对脑缺血再灌注后巢蛋白蛋白表达的影

4、响,探讨脑络欣通对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠神经干细胞(NSCs)增殖、分化影响的规律；着眼于中医药诱导内源性NSCs增殖、分化,从而探索出一条新的神经功能重建的干预调节机制。1  实验材料1.1  动物及分组    健康Wistar大鼠120只,雌雄各半,体重280320 g,河南医科大学实验动物中心提供(合格证号：YU-A-4100112)。实验前先饲养观察3 d。将120只动物随机分为假手术组、模型组、益气活血组(脑络欣通组)、益气药组和活血药组共5组,每组24只,1、3、7 d 不同时间点各8只。1.2  主要药物及试剂

5、60;   益气药由黄芪组成,活血药由三七、川芎等组成；脑络欣通由益气药和活血药组成。全部药物购自安徽中医学院第一附属医院中药房,安徽中医学院中药制剂室提供制剂。免疫组化染色SABC试剂盒、DAB显色剂、APES均购自武汉博士德生物工程有限公司。1.3  主要仪器FA2004型电子天平(上海天平仪器厂生产)；101-A恒温干燥箱(宁波自动化仪表厂)；TB-718自动石蜡包埋机(泰维电子设备有限公司)；LEICA-ASP200自动切片机(LEICA公司)；OLYMPUS-VANOX显微镜(日本OLYMPUS光学工业株式会社)； DP801形态学显微图像分析系统(南京

6、捷达科技发展有限公司)。2  实验方法2.1  造模参考Koizumi1法制作急性局灶性脑缺血动物模型。简要手术步骤如下：10%水合氯醛溶液(350 mL/kg)腹腔注射麻醉仰卧固定动物,备皮、消毒、作颈部正中切口,由颈总动脉分叉处向头端依次游离,电凝颈外动脉所有分支,切断颈外动脉,使其主干游离备用；用微型无损动脉夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉,剪刀在颈外动脉残端作一“V”形切口,将预先制备好头端涂有聚氨酯的线拴快速插入颈内动脉约(18.0±0.5)mm(至感觉有少许阻力为止),清理术野,全层缝合,关闭切口；阻塞时间为2 h,再灌注时将栓线抽出约10 mm,拔线时稍

7、有脱空感即止,将远端剪断约10 mm,以防动物苏醒后将栓线抓脱,导致大出血死亡。参考Longa2法于缺血2 h及再灌注1、3、7 d进行神经功能缺损体征评分。通过神经功能评分判断脑缺血模型的成功与否,23分为入选动物。  模型制备完成后大鼠虽然有脑缺血症状,但伴下列情形之一者不纳入：神经学症状评分低于2分者；取脑时发现蛛网膜下腔出血者；脑组织冰冻切片HE染色无缺血病理改变者；未到观察时间点便死亡者。凡因上述因素导致各实验组动物数不足预定数量者通过随机抽样原则补齐。2.2  给药    脑络欣通、益气药、活血药均由安徽中医学院中药制剂室制成汤剂,

8、分别相当于原药材2.25、3.75、6 g/mL。按以往药效学实验结果3,取最佳剂量,分别按每日3.5、5.04、8.54 g/kg灌胃。在制作局灶性脑缺血模型成功后30 min给药1次,以后每日早晚各1次。假手术组、模型组按同样方法予以等量生理盐水灌胃。2.3  组织处理    在各个相应的时间位点前,以10%水合氯醛(350 mL/kg)腹腔注射麻醉动物,然后打开胸腔,于右心耳部剪一小口,从左心室插入导管至主动脉,向内迅速注入37 肝素化生理盐水约200 mL,至右心耳流出液变清亮,然后注入4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液约350 mL,灌流固定30 mi

9、n后断头取脑,除去小脑和脑干,取缺血侧半脑,从视交叉处冠状面切开后放入相同的固定液中固定1周,脱水、透明、浸蜡,制作脑部冠状切片。2.4  巢蛋白免疫组化染色及观察    按试剂盒说明操作,采用免疫组化SABC法,阴性对照采用正常山羊血清替代第一抗体进行,每个时间段做8只大鼠,在视交叉后连续切8张冠状切片。根据大鼠脑缺血半暗带的定位方法4,用DP801图像分析系统,于额顶叶皮质或相近部位同倍(×400)的7个不同视野,统计每个视野下巢蛋白的平均光密度、阳性细胞总面积,分别取平均值。2.5  统计学方法    数据用x±s表示,用SPSS11.0统计软件处理,采用方差分析和t检验。3  结果(