荧光假单胞菌生防机理的研究进展

1、 收稿日期 :2006-11-14; 修回日期 :2007-04-02作者简介 :张伟琼 (1981- , 女 , 上海师范大学微生物分子生物学硕士研究生 , 主要从事微生物分子生物学研究 ; 通讯作者 :肖 明 E -mail:xiaom ing88,基金项目 :上海市科委重大项目 (批准号 :04DZl9304 ; 上海市教委重点项目 (05ZZl4 资助荧光假单胞菌生防机理的研究进展张伟琼 , 聂 明 , 肖 明(上海师范大学生命与环境科学学院 , 上海 200234摘 要 :荧光假单胞菌是植物根际促生细菌 (Plant Gr owth Pr omoting

2、Rhizobacteria, PGPR 具有分布广 、 数量多 、 营养 需要简单 、 繁殖快 、 竞争定殖力强的特点 。 , 成为 植物生防控制的重要研究对象 。 主要论述了荧光假单胞菌对植物病害生物防治机理的研究进展 关键词 :荧光假单胞菌 ; 生防机理 ; 植物病害 中图分类号 :Q939. 96文献标识码 :A:( -03 荧光假单胞菌 (P. fluorescens r RNA I 群荧光 DNA 同源组 1, 生物类群 , 具有分布广、 快 、 , 而且许多菌株能 , 2。其作用机制包括 :抗生素的作用、 噬铁素对铁的营养竞争、 有效的根际定 殖等。 近年来 , 随着分子生物学的广

3、泛渗入 , 通过对这 些作用机制的遗传性状进行分析 , 采用遗传工程加以 改良 , 使得荧光假单胞菌具有更诱人的生防效果 。 1 抗生素介导的抑制荧光假单胞菌产生的抗生素是它们抑制植物病害 的重要 因 素。它 们 产 生 的 抗 生 素 有 1-羧 基 吩 嗪 (phenazin -e -1-carboxylic acid, PCA , 藤黄绿脓菌 素 (pyoluteorin, Plt , 吡咯菌素 (pyrr olnitrin, Prn , 2, 4-二乙酰藤黄酚 (2, 4-diacetylphloroglucinol, DAPG , 绿 脓菌素 (pyocyanin , 卵菌素 A (

4、OomycinA 等。这些抗 生素具有一定的专一性 , 能够选择性地抑制病害。表 1列出了荧光假单胞菌产生的一些抗生素及其拮抗的 植物病原菌。目前的研究主要集中在 PCA 、 Prn 、 Plt 和 DAPG 这 几种抗生素上。 PCA 为吩嗪类物质 , 在细胞内作为电 子载体传递电子到靶细胞 , 增加胞内超氧化物自由基 , 使靶细胞中毒死亡 ; Prn 属于氨基糖甘类抗生素 , 在低 浓度时破坏氧化磷酸化的偶联机制 , 而在高浓度时阻 止参与呼吸作用的黄素蛋白和细胞色素 C 的电子运 输 3; Plt 和 DAPG 为聚酮类抗生素 , 具有广谱抗菌活 。1986年 Guuters on 等人

5、首次报道克隆得到菌株 P. fluorescens HV37a 的抗生素基因。该菌株抗生素的合 成与 转 录 单 位。 afuE 、 afaR 、 afuAB 、 afuP 有 关 , 其 中 afuAB 与调节相关。 之后越来越多菌株合成抗生素的 基因得到确定。在荧光假单胞菌 Q2-78中 phl ACBD 作为操纵子负责合成 DAPG 及其前体 , 下游基因 phlE 与 phl ACBD 共转录 , 与 DAPG 的分泌和细胞抗逆性相 关 , phlF 基因位于操纵子上游 , 以相反的方向转录 , 编 码 DAPG 阻遏蛋白 。 不同菌株 DAPG 合成基因序列具有较高的相似性 4。 D

6、m itri 等人测定了荧光假单胞菌 2-79中 PCA 合成相关基因 phz ABCD EFG, 其中 phzC 、 phz D 、 phzE 、 phzF 是 PCA 合成所必需的。 phzG 与 PCA 合成酶辅助因子相关。 phz A 和 phz B 具有高度同源性 , 与合成 PCA 的多酶复合物的稳定有关。不同荧光假单胞菌也具有相似的基因系统合成 PCA 5。荧光假单胞菌通过两组分调节系统 (t wo -co mpo 2nent regulation system 应答环境信号 , 系统由膜连接传 感激酶 (membrane -bound sens or kinase 和胞质效应蛋

7、 白 (cyt op las m ic response p r otein 组成 , 其中传感激酶起 环境感受器作用 , 而胞质效应蛋白介导根据传感信号 而变化的基因表达。 荧光假单胞菌的两组分调节系统 GacS/GacA 中 , gacS 基因编码膜连接传感激酶 GacS, gac A 基因编码胞质效应蛋白 GacA 。 gacS 或 gac A 突变 体丧火产生一系列抗生素的能力 , 从而失去对植物致 病菌的抑制能力。 如荧光假单胞菌 Pf -5的 gacS 突变 体丧失产生 Prn 、 Plt 、 DAPG 的能力 , 因此失去了对植物9第 24卷第 3期 2007年 6月生 物 学

8、杂 志 JOURNAL OF B I O LOGYVol 124 No 13Jun, 2007致病菌 Rhizoctonla solani 的抑制能力 。菌株 FPT960l 的 gac A 突变体不产生 DAPG 、 HCN 和蛋白酶 , 但产生过量的噬铁素 Sid 6。 随着两组分调节系统的鉴定 , 能 更好地提高荧光假单胞菌中抗生素的基因调控 。表 1 荧光假单胞菌产生的抗生素与其所拮抗的植物病原菌Table 1Antibi ofics of Pseudo m onas fluorescens and its functi on objects抗生素植物病原菌Pyrr olnitrin,

9、 PrnR hizoctonia solani Thielaviopsis basicola A lternana sp Pythium ulti m umPyoluteorin, PitPythium ulti m umPhenazine -1-Carboxylic Acid, PCA Gaeum anno m yces gram inis 2, 4-diacetyl phl or oglucinol, 2, 4-DAPGR hizoctonia solani Gaeum anno m yces gram inis Pythium ulti m umOomycin A Pythium ult

10、i m um 反应控制 , 而 GacS/GacA 。 D (70因子由 rpo D 基因编码 , Pf D 过量表达使 Plt 和 DAPG 产 量提高 , 而荧光假单胞菌 M18中 rpo D 过量表达增强了Plt 和 PCA 的生物合成。 S (38因子由 rpoS 基因编 码 , 在 M18中 rpoS 失活使其合成 PCA 的能力显著提 高 , 但对碳源饥饿 、 有机物 、 过氧化物和高渗透压的抗逆性降低 , 不利于菌体的生长 7。 Pf -5的丝氨酸蛋白 酶 Lon 突变体产生过量的 Plt, 并对 UV 较为敏感。 lon基因前端序列类似于 E . coli 热震荡 H (32因

11、子的启动子 , 因此 H因子也调节荧光假单胞菌种抗生素的产 生 8。 由此推测 , 荧光假单胞菌中抗生素合成的阻遏 蛋白的编码基因是依赖于 因子进行转录或者与 因 子相互竞争 RNA 聚合酶 。此外 , 抗生素的产生还受到不同生理条件的影响。 B rion 等发现荧光假单胞菌 CHAO 中 DAPG 及其前体化合物的产生受到 Zn 2+、 NH 4Mo 2+及葡萄糖的刺激 ; Plt的产生受 Zn 2+、 CO 2+和甘油的刺激但受葡萄糖的抑制 ; 果糖 、 甘露醇、 Zn 2+和 NH 4Mo 2+混合物能够增加 Prn 的产量 ; DAPG 产生的最适温度为 12。 Notz 等还发 现

12、Fusarium oxysporum 产生的镰刀菌酸能抑制 CHAO产生 DAPG 9。 2 噬铁素介导的抑制荧光噬铁素是由荧光假单胞菌产生的胞外水溶性 黄绿色素 , 是其特有的铁载体 。 19世纪 70年代 A ltam 等人首次提出荧光假单胞菌产生的噬铁素促进植物生 长并抑制植物病害。 1980年 Kl oepper 等首次从荧光假 单胞菌 B10中分离出具有植物病害抑制能力的荧光噬 铁素 。荧光噬铁素抑制植物病害的作用机理是在低铁环 境下荧光假单胞菌产生与铁离子有极高亲和力的荧光 噬铁素 , 形成铁 -噬铁素复合物。产生菌通过膜外专 一性受体利用复合物 , 而其它机体不能利用。因此荧 光

13、假单胞菌通过分泌噬铁素从环境中结合铁离子为自 身所利用 , 限制植物根际有害细菌和真菌的生长 , 防止 真菌孢子萌发。铁 -噬铁素复合物的摄取是由专一性膜外受体所 介导的 。 1986年 Buyer 等首次提出荧光假单胞菌具有 多种受体摄取不同的铁 -噬铁素复合物。他们发现菌 株 B10不仅能够利用菌株 A214, 而 B10A214, E . 蛋白在细胞外膜转运中介导膜内外 , 是 E . coil 所有铁 噬铁素复合物运输系统中 所必须 的。荧 光假 单胞 菌 358的 受 体 序 列 具 有 与 TonB 蛋白结合位点同源的区域 , 因此在荧光假单胞菌 中复合物也许也通过同样的方法穿过细

14、胞膜。大多细菌包括荧光假单胞菌具有 Fe 3+还原酶 , 噬铁素与二价 金属的亲和力极小 , 因此认为复合物与受体结合进入 细胞之后铁离子通过还原机制从噬铁素中释放出来。现已 发 现 的 荧 光 假 单 胞 菌 噬 铁 素 有 脓 青 素 (pyoverdine 、 假单胞菌素 (p seodobactin 、 绿脓菌螯铁 蛋白 (pyochelin 、 水杨酸 (S A 等。噬铁索的产生受到许多因素的影响 , 如 Co 2+、 果糖、 甘露醇、 葡萄糖和甘 油均能增加荧光假单胞菌 CHAO 中绿脓菌螯铁蛋白 (pyochelin 的产量 。 3 根部定殖事实上 , 荧光假单胞菌所有的疾病抑制

15、机制只有 在它们成功地在根际定殖后才能真正起作用。杨合同 等人以荧光假单胞菌 P32处理小麦种子 , 发现菌株能 在幼根表面形成一层均匀的保护层 ; 而没有防病作用 的菌株不产生保护层 , 说明荧光假单胞菌在根部定殖 时保护了病原菌的侵染位点 , 降低侵染机会 , 是防病的 关键因素之一。不同的荧光假单胞菌在不同的根际有不同的定殖 能力 。 有报道表明一株荧光假单胞菌定殖于土豆根际 时 , 在砂质土壤的定殖速度是粘土的 10倍 , 而另一株 则在砂质土壤的定殖能力高于泥炭土壤。虽然这表明 土壤的结构直接影响了菌株在根际的定殖 , 但其它与 土壤类型相关的间接因素如湿度、 温度、 pH 值等也是

16、 根部定殖不同的原因。其他生物体的存在也影响根际定殖 , 如蛭弧菌属 是土壤中革兰氏阴性菌的专性寄生菌 , Scherff 等发现 它们影响大豆根际中荧光假单胞菌的存活。 Daniel 等 发现土壤中存在大量噬菌体作用于不同的荧光假单胞1第 24卷第 3期 2007年 6月生 物 学 杂 志 JOURNAL OF B I O LOGYVol 124 No 13Jun, 2007菌 , 这些噬菌体对细胞的溶解也影响荧光假单胞菌的 定殖 。 当某一特殊噬菌体存在时敏感菌株的定殖能力 下降 , 而抗性菌株不受影响 。4 其它机制4. 1 次生抗性代谢物荧光假单胞菌还产生许多其它具有抗性的次生代 谢物

17、 , 与植物病原菌具有拮抗作用。 如许多荧光假单胞 菌产生的 HCN 能影响植物的病原菌。 M. Nagara jku mar 等发现荧光假单胞菌 Pf M DU2产生乙二酸 , 对植物病原 菌产生的草酸具有解毒作用 , 能够抗由 Rhizoctonia solani 引起的水稻疾病 10。 N ielsen 等发现荧光假单胞菌 96. 578产环形脂肽 , 对病原菌 Rhizoctonia solini 有拮抗作 用 11; 在沙质土壤中甜菜的根际发现大量荧光假单胞 菌产循环脂肽 CLPs (约 60% , 这些 CLPs 均表现出极 强的生物表面活性剂特性 ,物病原菌 12。 、 酶 、真

18、菌细胞壁 , W36株真菌的生长。4. 2一些荧光假单胞菌在根部的定殖能诱导植物对病 原菌产生系统抗性 (I nduced System ic Resistance, ISR , 水杨酸的积累被认为是重要因素 , 而脂多糖和噬铁素 也是重要的诱导物质。 诱导抗性的可能机制是产生抗 微生物的低分子量化学物质 , 如植物保护素、 双萜、 多 聚物 、 木质素等并诱导一些水解酶和氧化酶 13。 Van 等人用 P. fluorcescens W SC417处理康乃馨花 , 再接种 镰刀萎蔫病病原菌 , 明显提高了康乃馨的植物保卫素 水平 。 已发现一些生长旺盛的植物其内生的荧光假单 胞菌的数量特别高

19、 14, 这也许与内生荧光假单胞菌诱 导系统抗性作用有关。4. 3 基因工程构建随着基因工程的发展 , 更多的特性被引入荧光假 单胞 菌 , 使 其 能 更 有 效 地 抗 植 物 病 原 菌 。 1986年 Obukowicz 等将 B acillus thuringiensis 的 内毒素插入一 株荧光假单胞菌的染色体 , 使重组菌株能够抑制某些 昆虫 。 Fuchs 等将 Serratia m arcescens 甲壳酶编码基因 克隆到荧光假单胞菌并表达。在国内 , 丁之铨等人将 B t 杀虫基因导入荧光假单胞菌 P3O3, 工程菌 IPP202不仅在拮抗性方面没有减弱 , 并且还具有杀

20、虫作用 。 5 问题与展望荧光假单胞菌作为植物根际促生细菌对多种植物 病害具有防治作用 , 但在应用上仍有许多问题。荧光 假单胞菌的防治效果一般为 50%60%, 需通过优良 菌株的筛选提高效率。 次生代谢物抑制病害的具体机 制并未完全搞清 , 是否还有其他作用机制尚无定论。 基因研究表明在改进这些菌株生防控制能力及多样性 上还有极大的潜能 , 然而将基因修饰有机体 (G MO s 释 放到环境中却存在不可预测的风险。 因此这些都还有 待科学工作者的进一步研究。参考文献 :1东秀珠 , 蔡妙英 . 常见细菌系统鉴定手册 M.北京 :科学 出版社 , 2002. 162166.2李怀波 , 彭

21、珺 , 包 衍 , 等 . 拮抗油菜菌核病菌的荧光假单 胞杆菌的分离与筛选 J.中国农学通报 . 2005, 21:334337. 3金 颖 , 胡洪波 , 张雪洪 . 假单胞菌产生的抗生素研究 J .上海农业学报 , 2005, 21:1064周洪友 , 魏海雷 , 刘西莉 , 等 . 2, 4能 ., .M , Robert F B, et al . A Seven -gene l of phenazine -1-carboxylic acid by m onas fluorescens 2-79J .J. Bateri ol . 1998, 180 (9 :254l 2548.6Zhan

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25、n Pf M 2 DU2:i m p licati ons f or the bi ol ogical contr ol of rice sheath blight caused by R hizoctonia solani J .M icr obi ol ogical Re 2 search, 2005, 160:291298.11N ielsen T H, Thrane C, Christ ophersen C, et al . V iscosi 2 na m ide, a ne w cyclic dep si pep tide with surfactant and anti 2 fun

26、gal p r operties p r oduced by Pseudo m onas fluorescens DR54 J .J App lM icr obi ol, 2000, 89:9921001.12Nielsen T H, Soresen D, T obiaeen C, et al . Antibi otic and bi osurfactant p r operties of cyclic li popep tides p r oduced by fl ourescens Pseudo m onas s pp. for m the sugar beer phizos 2 pher

27、eJ .App l Envir on M icr obi ol, 2002, 68:34163423. 13杨海莲 , 孙晓璐 , 宋 未 . 植物根际促生细菌和内生细 菌的诱导抗病性的研究进展 J .植物病理学报 , 2000, 30:106110.14邹文欣 , 谭任详 . 植物内生菌研究新进展 J .植物学 报 , 2001, 43(9 :881892. (下转 24页 11第 24卷第 3期 2007年 6月 生 物 学 杂 志JOURNAL OF B I O LOGYVol 124 No 13 Jun, 2007决 , 我们可以根据旋转分子马达的运动机制发展出一 些新的设计思想 ,

28、如制造纳米级的生物器件 , 更加有效 的利用能源等等 , 利用分子马达在微观层次上的特有 的功能为人类服务。参考文献 :1George O ster, Hongyun W ang . Reverse engineering a p r o 2tein:the mechanoche m istry of ATP synthase J .B i ochi m B i ophys Acta, 2002, 1458(2-3 :482510.2韩英荣 , 旋转分子马达的代表 ATP 合成酶 J , 现代物理知识 , 2003, 3:710.3翟中和 , 王喜忠 , 丁明孝 . 细胞生物学 M, 北京 :

29、高等教育出版社 , 2000, 219.4K . Kinosita J r and others . A r otary molecular mot or that work at near 100%efficiency J .Phil R Soc B, 2000, 355, 473489.5George O ster, Hongyun W ang . W hy is the mechanical eff 2ciency of F 1-ATPase s o high J .Journal of B i oenergetics and B i omembranes, 2000, 32(5 :45

30、9469.6WUW ei -xia, ZHAN Yong, ZHAO T ong -jun, et al . D irect 2ed moti on of a molecular mot or based on the f our -state model with unequal substep s Commun J .Theor Phys, 2003, 40(1 914.7Jiangpeng,Ma J P, et al . A dyna m ic analysis of the r otati onmechanis m in F 1-ATPase J .2002, 10:921931.8Y

31、 Q, , p -based mod 2of ATP by F 1-ATPase 205, s rot ati on cat alysisstochasti c transiti on dynam i csZHENG Yan 1, 2, ZHAN Yong 1, HAN Ying -r ong 1,Y ANG M ing -jian 1, L I Chen -pu 1, Y U Kun1(1. School of Science, Hebei University of Technol ogy, Tianjin 300103, China; 2. Physics Depart m ent, H

32、andan Nor mal University, Hebei 056005, China Abstract:The ATPpases synthesize ATP using a trans me mbrane i on motive f orce established by electr oche m i 2cal gradient or revrse t o perf or m as i on pu mp using the hydr olysis energy of ATP . it has very high efficiency of ener 2gy transfor mati on, nearly 100%.I n this paper, baesd on the structure of the ATPase and the master equati on, a st o 2chastic hopp ing model which describes the r otary f our -state