被定位于发酵支原体表面的α烯醇化酶及其纤溶酶原活性

1、被定位于发酵支原体表面的烯醇化酶及其纤溶酶原活性摘要：结合与发酵支原体表面的纤溶酶原可以显著的增强发酵支原体与HElA细胞的结合能力，并且尿激酶纤溶酶原激活物能够加强该能力，并且在发酵支原体的内吞话过程中也有此特性。在试验中，我们通过亲和色谱分析法利用生物素标记的纤溶酶原与抗生物素抗体将溶解于Triton X-100的发酵支原体蛋白中的纤溶酶原结合蛋白分离并溶解于氨基己酸溶液中。将分离得到的50KD左右大小的蛋白经过质谱分析得出是烯醇化酶。烯醇化酶这种在糖酵解过程中的关键酶，通过免疫印记的方法应用抗烯醇化酶抗体被证明在发酵支原体的膜蛋白组分中找存在，并应用免疫电镜与免疫化学的方法验证了此结论。

2、蛋白凝胶电泳实验表明纤溶酶原具有阻碍抗烯醇化酶抗体与发酵支原体50KD组分结合的能力，该结论进一步证明了我们关于膜表面烯醇化酶是发酵支原体主要纤溶酶原金额和蛋白的推测。纤溶酶原(Plg)与发酵支原体表面结合可以作为一种标记物加强其同Hela细胞组织的结合能力，因为尿激酶活性的纤溶酶原激活剂可加强纤溶酶原活性从而着引导了宿主细胞对发酵支原体的内吞作用加强。在我们的研究中，通过应用亲和色谱法我们通过用经过生物素标记的纤溶酶原结合柱分离用Triton X-100溶解的发酵支原体膜蛋白获取分析其中具有纤溶酶原活性的的蛋白从而找到一种氨基酸。通过对这个50KDa 大小的蛋白质进行质谱分析得知它是烯醇化酶

3、。应用抗烯醇化酶的抗体做的免疫印记分析证明烯醇化酶这种在胞内糖酵解过程中的关键酶在发酵支原体表面也存在，并且通过免疫化学与免疫电镜验分析验证了上述结论。我们还通过对膜表面蛋白western实验证明纤溶酶原具有阻碍抗烯醇化酶抗体同烯醇化酶结合的作用从而证明了位于膜表面的烯醇化酶是发酵支原体表面的主要纤溶酶原结合蛋白。支原体（柔膜菌纲）是一种没有细胞壁并广泛分布于自然界的一种生物。多数支原体是寄生生存，并且具有严格的宿主和组织特异性，且几乎所有的种类都附着于真核细胞的表面生存。在细胞定殖以及后续的疾病侵染过程中对宿主细胞的粘附作用是是初始并是必要的一步，从而导致了粘附缺陷株即无致病力毒株。几十年前

4、人们就从人的泌尿生殖系统中分离到具有致病作用的发酵支原体。最近有研究表明该支原体可能是引起人关节炎的一种病原体因此对该病原的研究持续升温。纤溶酶原是一种92KDa大小的真核生物内存在的糖激酶活性的蛋白，并且其在体内可通过赖氨酸的激活作用使其转化为纤溶酶从而具有降解纤维蛋白与非胶原蛋白活性。纤溶酶活性在众多生理与病理过程中都起到重要作用例如：纤维蛋白与细胞周质蛋白水解、癌细胞的迁移以及神经元细胞的死亡。众多真核细胞在其细胞表面会表达与纤溶酶相互作用的立体结构，并且也已尽有人在细胞表面发现与纤溶酶相应的受体。赖氨酸以及赖氨酸活性类似物例如在羧基端有游离的赖氨酸残基的氨基酸链都会对纤溶酶活性起到抑制

5、作用。最近的研究已尽表明纤溶酶原可以同大量的革兰氏阳性以及阴性菌其反应。发酵支原体是一种典型的胞外寄生菌，它寄生于人类上皮细胞表面。我们的研究表明了发酵支原体具有纤溶酶原结合活性并且纤溶酶原的结合能够加强发酵支原体同HeLa细胞的结合作用。此外，在尿激酶活性的纤溶酶原激活剂存在的情况下，在宿主细胞胞内检测到了发酵支原体表明了纤溶酶原的结合活性以及纤溶酶原转化为纤溶酶都能够加强发酵支原体侵染宿主细胞。多种细菌都能够产生纤溶酶分解细胞周质从而利于它们能够在组织上侵染与扩散。细菌在其表面表达纤溶酶原的受体这样将有利于血纤溶酶原与来自原核或者真核生物的血纤溶酶原激活剂接触来加强血纤溶酶原的活性。也就是

6、说细菌通过应用血纤溶酶原的受体与激活剂来达到利用宿主细胞系统是本身具有蛋白水解酶的能力。对于革兰氏阴性菌来说其表面的纤毛与菌毛是受体的主要存在位点。对于革兰氏阳性菌来说其表面类似于M蛋白样分子结构的表面粘附细胞器是受体的存在位点。作为糖酵解酶的烯醇化酶以及三磷酸甘油醛脱氢酶在肺炎链球菌中作为非经典的血纤溶酶原结合蛋白被发现。纤溶酶原与肺炎链球菌烯醇化酶的结合是通过赖氨酸残基端地结合集团与烯醇化酶的羰基端以及内部的FYDKERKVYD表面集团相互作用实现的。在我们的研究中我们分离鉴定并表达了发酵支原体中作为表面能够结合纤溶酶原的烯醇化酶。材料与方法样本及其生长环境。使用菌株为发酵支原体PG-18

7、菌株（由S.-C. Lo, Armed Forces Institute of Pathology, Washington, DC惠赠），样本组织用含有5的马血清的Chanock培养基来培养。样本组织在37下培养24-48小时，在培养过程中时刻监控培养基在640nm吸光度值与PH值的变化。12000g，20min离心收集组织样品，清洗两遍，用冷的含有10mM的Tris-HCl、250 mM NaCl（PH7.4，参照下文中TN缓冲液的配置）溶液重悬。总蛋白量应用Bradford方法进行定量并将蛋白稀释为0.5ug/ml到1.0ug/ml.细菌的计数通过平板计数法计算稀释后单个菌落数获得。从菌体

8、中获取膜蛋白上以及可溶性蛋白应用超声破碎的方法。获取的组分冲洗两遍并用TN缓冲液重悬备用。层析法与质谱法利用层析法从人的血浆中获取2.5mg的纤溶酶原，并应用分配器按照说明书对纤溶酶原标记上生物素。标记有生物素的纤溶酶原与附着有抗生物素蛋白的丙烯材料制备的小珠子（sigmar）共同于缓冲液中室温孵育2h。用玻璃柱收集孵育完毕的珠子冲洗两遍，并用含有1mM EDTA的PBS平衡。在填充柱中分离用含有2Triton X-100的溶液溶解的发酵支原体细胞膜组分。填充柱用还有2Triton X-100与1mM EDTA的PBS冲洗两遍，然后用10-50mM的ACA溶液冲洗结合有纤溶酶原结合蛋白的珠子。

9、获取的样品经过透析、冷冻干燥后用蛋白胶上样缓冲液重悬，然后应用4-20梯度的SDS-PAGE进行凝胶电泳。生物素标记的纤溶酶原蛋白在结合反应后应用考马斯亮蓝染色在50KD处可见主要的结合条带，用银染方法染色后还可以看见4条非主要的结合条带（45KD 55KD 70KD 75KD）。应用MS方法对49KD处用考染可见的主要的纤溶酶原结合蛋白条带处获取蛋白样品并对其分析。将MS获取的短肽链信息与MS相关信息应用BioLynx package软件进行分析，其结果可在Mascot package 上查询。应用BLAST在NCBI的数据库中输入获取的蛋白样品特征数据进行分析。烯醇化酶的定位 应用斑点杂交

10、的方法对全菌蛋白、膜蛋白、包浆蛋白的可溶性组分进行分析。醋酸纤维素膜应用含有1BSA的PBS溶解的脱脂乳在室温下封闭1h，应用兔抗烯醇化酶抗体1:200被稀释在4下孵育16h，用过氧化物辣根标记的鼠抗兔IgG酶标二抗室温孵育1h，显色。为了检测宪溶酶原对抗烯醇化酶抗体与烯醇化酶结合能力影响的大小，我们对发酵支原体可溶性蛋白组分进行SDS-PAGE。蛋白通过电专的方法将胶上的蛋白转印到醋酸纤维素膜上，并应用没有纤溶酶原（15ug）存在的抗烯醇化酶抗体溶液与具有纤溶酶原同抗烯醇化酶抗体一起孵育的作对照，其后的反应如上文所述。应用ELISA方法对兔抗烯醇化酶血清对发酵支原体可溶蛋白组分的的抗体稀释度

11、进行测定。ELISA空板子用发酵支原体全菌蛋白包被（包被浓度为0.1 到 5.0 ug/孔，溶解在含有10mM CaCl2 的TN缓冲液中），应用含有1BSA PBS的脱脂乳室温封闭2h，1:200倍兔抗烯醇化酶血清室温孵育2h。再用过氧化物辣根标记的鼠抗兔二抗37孵育1h，显色，测吸光度值。电镜技术 为了在亚细胞结构上确认烯醇化酶存在的位置，我们利用透射电镜对金标记的发酵支原体进行观察，其中发酵支原体为在Chanock培养基上生长到对数期后经过TN缓冲液冲洗两遍后获取的。将菌体蛋白浓缩到200ug/ml，将获取的做分利用含有5胎牛血清的TN缓冲液封闭30分钟，其后1:50倍用含有1BSA的T

12、N缓冲液稀释兔抗烯醇化酶血清低温孵育24个小时。经过TN缓冲液的三次洗涤，用金标记的山羊抗兔二抗（Jackson ImmunoResearch Laboratories）在室温下孵育三个小时。样品经过TN缓冲液的两次洗涤，用含有2甲醛以及2戊二醛的0.2M甲次砷酸盐溶液（PH7.4）低温固定30分钟。样品在经过冷冻切片处理后对其进行电镜观察。结果与讨论已经有报道说明，在有些支原体的表面纤溶酶原结合活性是具有赖氨酸依赖活性的。纤溶酶原能够结合在发酵支原体表面，并且这种结合加强了它对HeLa的粘附能力都说明了在纤溶酶原的帮助下发酵支原体是通过结合HeLa细胞表面几个特定位点实现粘附过程的。众多细菌

13、在其表面都表达纤溶酶原结合受体，这些受体结合纤溶酶原并且这些纤溶酶原在激活剂的存在下转化为纤溶酶酶从而在细菌的侵染过程中起到促进作用。此外，包括发酵支原体在内的众多细菌的侵染力都与其纤溶酶原结合能力与纤溶酶原转化为纤溶酶有关。应用发射自显影技术，在发酵支原体蛋白组分中找到俩个条带能与I125标记的纤溶酶原反应。我们应用生物素标记的纤溶酶原以及生物素结合吸附柱对发酵支原体膜上的以及可溶组分的蛋白进行分离纤溶酶原结合蛋白。最终获取了主要的一种大小为50KD的蛋白并溶解于ACA溶液中。对获取的样品进行处理并通过MS-MS分析。通过对结果进行分析，结果显示出高度可信的该蛋白与其他支原体的烯醇化酶为同一

14、种蛋白。通过应用配体实验、ELISA实验和电镜实验证明烯醇化酶这种糖酵解酶存在于发酵支原体表面。图表一的免疫斑点试验表明在发酵支原体的膜蛋白组分中可以应用兔抗烯醇化酶抗体检测到烯醇化酶的存在。此外还可以看到，膜蛋白组分中的烯醇化酶含量高于可溶性蛋白组分。实验结果还显示，不管是应用含有NaCl（浓度可高达1M）的10 mM Tris缓冲液（pH 7.5）还是含有10mM EDTA的TN缓冲液作为洗涤液都对烯醇化酶抗体水平都没有影响。表二显示出兔抗烯醇化酶抗体与发酵支原体反应的抗体水平。通过三维电镜可以跟直观的看出兔抗烯醇化酶抗体与发酵支原体的结合反应（图表3）显示出烯醇化酶存在于发酵支原体表面。

15、图表四显示的纤溶酶原阻碍了抗烯醇化酶抗体与发酵支原体表面以及可溶性组分SDS-PAGE中50KD蛋白的结合反应，从而证实了我们关于烯醇化酶作为发酵支原体表面的主要纤溶酶原结合蛋白的推论。此外我们还通过利用在孵育溶液中加上商品化地烯醇化酶阻碍了纤溶酶原与发酵支原体的结合，进一步验证开了我们的结论（没显示数据）。即是增加足够大量的烯醇化酶（20 mg/孔），在发酵支原体蛋白组分与纤溶酶原结合反应中也只是能够抑制大约50结合能力，因此可推断在发酵支原体表面还存在着其它的纤溶酶原结合蛋白。获取发酵支原体全基因组序列（来自A. Strittmatter, The University of Goettingen, personal communications）让我们能够进一步研究发酵支原体中烯醇化酶的基因序列。通过基因序列可计算出该氨基酸连有454个氨基酸残基组成，并计算出其大小为49,276 Da。在NCBI的数据库中BLAST该烯醇化酶的氨基酸序列。通过ClustalW方法分析比对了发酵支原体烯醇化酶的氨基酸序列同其它生物体该蛋白的相似性。同肺炎双球菌一样，发酵支原体中的烯醇化酶缺乏锚定在膜上的典型序列或者结构域。不但多种支原体的烯醇化酶基因序列之间