苦参碱对表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞P物质受体和细胞因子表达的影响

1、苦参碱对表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞P物质受体和细胞因子表达的影响刘继勇，王玫，李凤前，朱全刚，孙华君，胡晋红基金项目：军队医药卫生十五重点课题（01Z66），上海市科委基础研究重点项目（No 05JC14046） *Corresponding author Tel:86-21-25070665, Fax: 86-21-25070668, E-mail: hujh （第二军医大学 长海医院 药学部，上海 200433） 摘 要： 研究苦参碱对表皮角质形成细胞系HaCaT细胞和真皮成纤维细胞P物质受体表达的影响，并探讨苦参碱对P物质诱导两种细胞表达IFN-、IL-1、IL-6及IL-8的影响

2、。采用流式细胞术和Western blotting检测分析苦参碱对两种皮肤细胞P物质受体表达的影响；以P物质刺激HaCaT细胞和真皮成纤维细胞，加入不同剂量的苦参碱共孵育，采用ELISA方法测定苦参碱对IFN-、IL-1、IL-6及IL-8分泌的影响。结果表明，苦参碱显著抑制HaCaT细胞和真皮成纤维细胞P物质受体的表达；P物质刺激可以显著增加HaCaT细胞和真皮成纤维细胞IFN-、IL-1、IL-8的分泌量；不同浓度的苦参碱均可以抑制皮肤细胞IL-1、IL-8的分泌，但对IFN-的分泌无明显影响。P物质和苦参碱对两种皮肤细胞IL-6的产生均无显著影响。关键词： 苦参碱；P物质受体；HaCaT

3、细胞；真皮成纤维细胞；细胞因子Effect of matrine on the expression of substance P receptor and cytokines production in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts.LIU Ji-Yong, WANG Mei, LI Feng-Qian, ZHU Quan-Gang, SUN Hua-Jun,HU Jin-Hong*(Department of Pharmacy，Changhai Hospital，Second Military Medical Un

4、iversity，Shanghai 200433，China)ABSTRACT To investigate the effect of matrine on the expression of neurokinin 1 receptor (NK-1R) and cytokines production induced by substance P (SP) in HaCaT cells (a human epidermal keratinocyte cell line) and dermal fibroblasts. The effect of Matrine on the expressi

5、on of NK-1R protein was detected by flow cytometry and Western blotting analysis.The modulation of Matrine on the production of interferon (IFN)-, interleukin (IL)-1, IL-6 and IL-8 in HaCaT cells and fibroblasts was measured by ELISA. The results showed that Matrine significantly inhibited the expre

6、ssion of NK-1R in HaCaT cells and fibroblasts. SP induced the production of IFN-, IL-1 and IL-8 in both cell types. Matrine 10-100g·mL-1 inhibited SP-induced IL-1 and IL-8 production in HaCaT cells and fibroblasts, while had no effect on the production of IFN- in both cells. Both SP and Matrine

7、 had no effect on the secretion of IL-6 in HaCaT cells and fibroblasts. These findings suggest that Matrine may be involved in the treatment of skin inflammation induced by SP by inhibition the expression of substance P receptor and regulation the production of IL-1 and IL-8 in epidermal keratinocyt

8、e and dermal fibroblasts.Key words: Matrine; substance P receptor; HaCaT cell line; fibroblast; cytokines; skin inflammation近年来，随着“皮肤免疫系统”概念的建立和研究的不断深入，皮肤的免疫功能日益受到研究人员的重视。皮肤免疫细胞主要包括树突状细胞（dendritic cells，DC）、朗格罕氏细胞（Langerhans cells，LC）、黑色素细胞（melanocytes，MC）、淋巴细胞及巨噬细胞等，这些细胞在皮肤免疫和皮肤炎症中的作用已得到了深入研究1。但对于占

9、表皮组成约95的表皮角质形成细胞（keratinocytes）和构成真皮的主要细胞真皮成纤维细胞（fibroblasts）在皮肤免疫和皮肤疾病中的作用却少有报道。P物质作为一种速发型过敏反应的炎症介质，已被证实参与了皮肤免疫和炎症的调控过程，如促进细胞增殖，诱导细胞分化，调节细胞因子、粘附分子和趋化因子等活性介质的释放等。P物质通过与高亲和力的P物质受体（neurokinin-1 receptor, NK-1R）结合或直接激活细胞内的G-蛋白级联反应作用于皮肤细胞，从而调节皮肤免疫和炎症反应，在神经-内分泌-皮肤免疫系统网络中具有重要作用2,3。 苦参碱为豆科植物苦参Sophora flave

10、scens Ait.的主要成分，具有抗炎、抗过敏、抗心率失常及抗肿瘤等广泛的生理活性。在治疗皮肤疾病方面，苦参“苦可除热，寒可凉血，燥可胜湿”，是外用治疗银屑病、皮肤瘙痒、荨麻疹等炎症性皮肤病最常用的中药之一4。本研究采用由人腹部表皮衍化而成，具有与正常人表皮角质形成细胞相似分化特征的HaCaT细胞株和经原代培养的真皮成纤维细胞为工具，考察苦参碱对P物质受体在这两种细胞上表达的影响，并探讨了P物质和苦参碱对HaCaT细胞和真皮成纤维细胞分泌细胞因子IFN-、IL-1、IL-6及IL-8的影响，为进一步阐明P物质介导皮肤变态反应的机制及苦参碱抗皮肤过敏的作用靶点提供依据。材料与方法 药品与试剂

11、苦参碱（Matrine，Mat，上海融禾医药科技发展有限公司，纯度98%）； Substance P （SP, Sigma公司）； 人角质形成细胞无血清培养基（K-SFM，Gibco/BRL公司）；DMEM培养基（Gibco/BRL公司）；新生胎牛血清（FBS，杭州四季清生物制品公司）；胰蛋白酶（tissue culture grade，AMRESCO）；胶原酶（CLS-1,Worthington Biochemical Corp.）；分散酶（AMRESCO）；山羊多克隆P物质受体抗体（美国Santa Cruz公司），工作浓度1200；HRP-兔抗山羊二抗（丹麦DAKO公司），工作浓度1100

12、；FITC兔抗山羊IgG（武汉博士德生物工程公司，Boster），工作浓度150；Human IFN- ELISA Kit（Bender Medsystems GmbH，Vienna，Austria）；Human IL-1、IL-6、IL-8 ELISA Kit 仪器 流式细胞仪 （美国Becton Dickinson公司）；垂直电泳系统（Mini-PROTEA）（美国Bio-Rad公司）；转印系统（Mini Trans-Blot）（美国Bio-Rad公司）；UVPBioimaging Systems（美国UPLand公司）；MK2型酶标仪（芬兰 Labsystem公司）； Multiskan

13、 洗板机（芬兰Labsystem公司）；Camera controller（日本Hamamatsu公司）；SDJ-ZS型生物洁净工作台（上海淀山湖净化设备厂）；二氧化碳培养箱（美国FORMA公司）。细胞培养 HaCaT细胞株由美国NIH米庆胜教授提供，培养基采用人角质形成细胞无血清培养基，置于5% CO2，37 饱和湿度孵箱中培养5。真皮成纤维细胞采用我室建立的培养方法进行培养6，培养基为含10%小牛血清的DMEM，置于5% CO2，37 饱和湿度孵箱中培养，每2-3天换液传代,取第6代以后的细胞进行试验。流式细胞分析 取生长良好的HaCaT细胞和真皮成纤维细胞，以1×108个

14、83;L-1密度接种于6孔培养板，分为空白对照组、SP（10-8 mol·L-1）刺激组、Mat（10-6 mol·L-1）组、NK-1R特异性拮抗剂Spantide I（10-5 mol·L-1）组及SP分别与Mat、Spantide共孵育组，每组设3复孔，作用时间均为24 h。待各处理组细胞增殖近融合后，按文献方法处理7，加入NK-1R山羊多克隆抗体2.5 L及兔抗山羊IgG-FITC 3 L，室温孵育、洗涤后以流式细胞仪检测细胞表面平均荧光强度（average fluorescence intensity，AFI）。Western blotting分析 取H

15、aCaT细胞和真皮成纤维细胞，以2×108个·L-1密度接种于100 mm培养皿中，置于孵箱中培养。细胞生长近融合后，弃去上清液，以无血清DMEM为空白对照，分别加入含SP、Mat和Spantide的培养基进行培养24 h。按文献方法8进行蛋白抽提及SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，加入NK-1R山羊多克隆抗体（1100）2 L及HRP标记的兔抗山羊二抗（15000）36+ L，室温孵育、洗膜后以显影液显影，置UVP成像系统中摄影，定位。ELISA测定 以1×108个·L-1的密度将细胞接种于24孔培养板，置恒温培养箱中培养24 h，待细胞平稳生长7080

16、融合后，换以无血清DMEM培养基，静息24 h。以无血清DMEM为空白对照，加入含SP和不同浓度Mat的培养基进行培养，每组平行设3复孔，继续培养24 h。吸取上清液，1000 rpm离心5 min，-20保存。采用ELISA方法检测上清液中IFN-、IL-1、IL-6及IL-8的含量。统计分析 实验数据以±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行处理，组间比较采用Students t检验进行。结 果1 Mat抑制HaCaT细胞和真皮成纤维细胞上NK-1R的表达流式细胞术检测表明，NK-1R在HaCaT细胞和真皮成纤维细胞表面均有显著的阳性表达。SP （10-8 mol·L

17、-1）可以使HaCaT细胞和真皮成纤维细胞上NK-1R的平均表达量上调39.3%（P<0.01）和47.0%（P<0.01）。Mat（100 g·mL-1）或Spantide（10 mol·L-1）单独作用于两种皮肤细胞，对细胞上NK-1R的表达均无显著影响。将Mat或Spantide与SP共孵育，均能抑制SP诱导的两种皮肤细胞上NK-1R的表达。Mat可使HaCaT细胞和真皮成纤维细胞上NK-1R的平均表达量分别下调33.0%（P<0.05）和44.5（P<0.01），Spantide 可使两种细胞上NK-1R的平均表达量分别下调43.1%和46.

18、1%（P<0.01），（见图1）。 Western blotting 分析表明，Mat可以显著抑制NK-1R在HaCaT细胞和真皮成纤维细胞上的蛋白表达，结果见图2、图3。*#Fig.1 Effect of matrine on the expression of neurokinin-1 receptor (NK-1R) in HaCaT cells and fibroblasts. Cells were preincubated as follows for 24 h before detection. The average fluorescence intensity (AFI)

19、 was determined by flow cytometric analysis. 1.control; 2.matrine 100g/mL; 3.Spantide 10mol/L; 4.SP10nmol/L; 5.SP 10nmol/L+matrine 100g/mL; 6.SP 10nmol/L+Spantide 10mol/L.Results are shown as mean ± SD values from three independent experiments. # P<0.01 vs control. *P<0.05, * P<0.01 vs

20、. SP treated.（a） （b） 1 2 3 4 5 6Fig.2 Effect of matrine on the expression of neurokinin-1 receptor (NK-1R) in HaCaT cells by Western blotting analysis. Cells were preincubated as follows for 24 h before detection. 1.control; 2.matrine 100g/mL; 3.Spantide 10mol/L; 4. SP 10nmol/L +matrine 100g/mL; 5.

21、SP 10nmol/L+Spantide 10mol/L; 6.SP10nmol/L. (a) The protein expression of NK-1R in HaCaT cells.(b) -actin served as the internal control. （a）（b） 1 2 3 4 5 6Fig.3 Effect of matrine on the expression of neurokinin-1 receptor (NK-1R) in fibroblasts by Western blotting analysis. Cells were preincubated

22、as follows for 24 h before detection. 1.control; 2. SP 10nmol/L +matrine 100g/mL; 3. SP 10nmol/L+Spantide 10mol/L; 4. matrine 100g/mL; 5. Spantide 10mol/L; 6.SP10nmol/L. (a) The protein expression of NK-1R in fibroblasts.(b) -actin served as the internal control.2 Mat对HaCaT细胞分泌IFN-、 IL-1、IL-6及IL-8的影

23、响 HaCaT细胞自身可分泌少量IFN-、IL-1、IL-6及IL-8。以10nmol·L-1 SP刺激HaCaT细胞24 h后（10 g mL-1Con A共孵育），SP可以显著增加HaCaT细胞IFN-、IL-1、IL-8的分泌量，分别由（27.3±4.8）ng·L-1、（22.2±1.4）ng·L-1、（34.1±3.9）ng·L-1升高到（75.4±2.2）ng·L-1、（37.0±5.6）ng·L-1和（46.9±9.1）ng·L-1。将不同浓度的Mat与

24、SP共孵育，10 g·mL-1和50 g·mL-1的Mat对IFN-的分泌无明显影响，100 g·mL-1的Mat可增加IFN-的分泌量，但与对照组无显著差异（P>0.05）。不同浓度的Mat均可以抑制SP诱导的IL-1和IL-8的分泌，其中100 g·mL-1的Mat可以使IL-1和IL-8的表达分别降低49.2%和58.4% （P<0.01）。但SP和Mat均对HaCaT细胞IL-6的分泌无显著影响 （P>0.05）。结果见表1。Tab. 1 Effect of Matrine on the production of IFN-,

25、IL-1, IL-6 and IL-8 in cultured human HaCaT cells ( n=3,±s )GroupDose/ mol·L-1IFN-IL-1IL-8IL-6C IR/ng·L-1 /%C IR/ng·L-1 /%C IR/ng·L-1 /%C IR/ng·L-1 /%ControlSPMatSP+Mat-10-810-410g/mL-150g/mL-1100g/mL-127.3±4.875.4±2.235.5±4.584.0±4.372.9±9.696.

26、5±12.1-11.43.3-27.922.2±1.437.0±5.626.8±3.632.2±2.1*22.3±1.3*18.8±1.7*13.039.849.234.1±3.946.9±9.131.7±5.822.8±2.3*21.2±1.7*19.5±2.2*51.454.858.444.3±9.548.5±7.841.8±5.643.4±4.742.5±3.643.3±4.210.512.410.7

27、 P<0.01 vs control. *P<0.05, * P<0.01 vs. SP treated （IR=Inhibition rate）3 Mat对真皮成纤维细胞分泌IFN-, IL-1、IL-6及IL-8的影响 真皮成纤维细胞分别与不同浓度的Mat共孵育，以10nmol·L-1 SP刺激24 h后（10 g mL-1Con A共孵育），用ELISA试剂盒测定细胞上清液中IFN-、IL-1、IL-6及IL-8的浓度。结果表明，SP可以显著增加成纤维细胞IFN-、IL-1、IL-8的分泌量，分别由（54.5±5.1）ng·L-1、（22.

28、3±2.8）ng·L-1、（563.6±41.9）ng·L-1升高到（86.5±14.2）ng·L-1、（40.5±4.8）ng·L-1和（632.6±53.9）ng·L-1。与HaCaT细胞相似，10 g·mL-1和50 g·mL-1的Mat对IFN-的分泌无明显影响，100 g·mL-1的Mat可增加IFN-的分泌量，但与对照组无显著差异（P>0.05）。不同浓度的Mat均可以抑制SP诱导的IL-1和IL-8的产生，其中10-4 mol·L-1的

29、Mat可以使IL-1和IL-8的表达分别降低47.4%和39.0% （P<0.01）。但对IL-6的分泌无显著影响（P>0.05）。结果见表2。Tab. 2 Effect of Matrine on the production of IFN-, IL-1, IL-6 and IL-8 in cultured human fibroblasts ( n=3,±s )GroupDose/mol·L-1IFN-IL-1IL-8IL-6C IR/ng·L-1 /%C IR/ng·L-1 /%C IR/ng·L-1 /%C IR/ng

30、83;L-1 /%ControlSPMatSP+Mat-10-810-410g/mL-150g/mL-1100g/mL-154.5±5.186.4±14.262.5±7.284.9±10.488.2±2.4100.7±12.21.7-2.1-16.622.3±2.840.5±4.826.4±1.228.3±3.5*23.2±2.1*21.3±3.2*30.142.747.4563.6±41.9632.6±53.9582.0±51.1476.6&#

31、177;35.6*428.1±38.4*386.2±42.3*24.732.339.017.1±2.720.6±2.520.0±2.119.8±1.918.9±3.218.5±2.34.08.310.2 P<0.01 vs control. *P<0.05, * P<0.01 vs. SP treated.（IR=Inhibition rate）3 讨论P物质是最早发现的一种神经肽，广泛分布于哺乳动物中枢和周围神经系统以及外周组织中，是除传统神经递质如乙酰胆碱、5-羟色胺、儿茶酚胺等以外的第3类神

32、经活性物质。P物质通过与神经激肽（neurokinin）受体结合发挥作用，其中与神经激肽-1受体（NK-1R）的亲和力最强。因此，NK-1R又特异性的称为P物质受体。P物质参与皮肤疾病的免疫调控并非直接刺激免疫系统，而是通过与各类免疫细胞上的NK-1R结合，间接调节免疫反应9-10。在P物质介导的许多皮肤炎症中，NK-1R与其它炎性介质之间存在正反馈调节机制，共同参与诱导皮肤细胞因子网络系统，构成协同放大效应。我们前期的研究已经证实11，在皮肤表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞上均存在有NK-1R的阳性表达，它参与介导了皮肤炎症的病理过程。本研究探讨了苦参碱对P物质受体在表皮角质形成细胞株HaC

33、aT细胞和真皮成纤维细胞上表达的影响。流式细胞术和Western blotting 分析均表明，苦参碱可以显著抑制NK-1R在HaCaT细胞和真皮成纤维细胞上的表达。NK-1R可能是苦参碱抗皮肤过敏作用的一个新的靶点。细胞因子和趋化因子在多种皮肤疾病的病理过程中具有重要作用。P物质可以调节巨噬细胞、单核细胞分泌TNF-、IL-1、IL-6、IFN-等12。在本研究中，我们考察了苦参碱对P物质诱导的两种皮肤细胞分泌IFN-、IL-1、IL-6和IL-8的影响。IFN-主要由Th1细胞产生，是重要的免疫调节因子。IFN-能增强Th1细胞的活性，增强细胞免疫功能；通过对Th2细胞的增殖的抑制作用抑制

34、体液免疫的反应性。IFN-抑制Th2细胞产生IL-4，并抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE13。因此可见，IFN-对皮肤过敏性疾病的转归具有正性调节作用。本研究证实，HaCaT细胞和真皮成纤维细胞自身可以分泌IFN-，P物质可以上调IFN-在这两种细胞上的表达，高浓度的苦参碱可以使IFN-的分泌量增加，但与对照组无显著差异。上述研究表明，苦参碱的抗皮肤过敏作用可能不是通过影响皮肤细胞IFN-的分泌而实现的。 IL-1是皮肤炎症反应中一种多效的细胞因子，它参与了皮肤免疫的调控过程。已有研究表明，离体的皮肤角质形成细胞可以同时分泌IL-1 和 IL-114。我们的研究也证实，表

35、皮HaCaT细胞和真皮成纤维细胞均可以产生IL-1，P物质促进了IL-1的产生，苦参碱对两种细胞IL-1的表达均有显著的抑制作用。抑制IL-1的产生是苦参碱抗皮肤过敏的一个新的作用环节。IL-8是趋化因子家族成员，参与了多种炎症性皮肤病的发病过程。IL-8及其受体在表皮和真皮细胞中均有表达15。我们的研究发现，HaCaT细胞和真皮成纤维细胞IL-8的分泌差别很大，HaCaT细胞可以分泌少量的IL-8，而真皮成纤维细胞却分泌大量的IL-8（>500pg/ml）。苦参碱可以显著抑制P物质诱导的两种细胞IL-8的产生。本研究中，无论是P物质还是苦参碱对IL-6的表达均无显著影响，这可能与细胞种

36、类和刺激因素有关，IL-6在皮肤炎症中的作用机理还有待进一步研究。参考文献1 Ansel JC, Kaynard AH, Armstrong CA, et al. Skin-nervous system interactions J. J Invest Dermatol, 1996,106:198-204.2 Thomas A. Luger. Neuromediatorsa crucial component of the skin immune system J. J Dermatol Sci, 2002, 30:87-93. 3 Richard. L, OSullivan, Graeme

37、Lipper, et al. The neuro-immuno-cutaneous-endocrine network: Relationship of mind and skin J. Arch Dermatol, 1998, 134:1431-1435. 4 Xu CQ, Dong DL, Du ZM, Chen QW, Gong DM, Yang BF. Comparison of the anti-arrhythmic effects of matrine and berbamine with amiodarone and RP58866. Acta Pharmaceutica Sin

38、 2004; 39:691-4.5 Zhu QG, Hu JH, Fan GR et al. Metabolism of ketoprofen isopropyl ester in HaCaT cells J. Chin Pharm J（中国药学杂志）,2003, 38: 22-25.6 Zhu QG , Hu JH, Fan GR, et al . Metabolism of ketoprofen isopropyl ester in skin cells J. Chin Hosp Pharm J（中国医院药学杂志）, 2002, 22 :195-197.7 Marriott I, Bost KL. Expression of authentic substance P receptors in murine and human dendritic cellsJ. J Neuroi