川芎嗪对脑缺血后不同脑区神经元型NO合酶表达的影响

1、川芎嗪对脑缺血后不同脑区神经元型NO合酶表达的影响         11-01-07 11:36:00     编辑：studa20                    作者：邱芬，刘勇，马波，祁存芳，王文静【摘要】  目的 通过观察脑缺血后不同时间、不同脑区神经元型NO合酶(

2、nNOS)的表达，探讨川芎嗪对脑缺血后nNOS表达的影响。方法 成年雄性SD大鼠，随机分为假手术组、缺血模型组及川芎嗪低(20mg/kg)、中(40mg/kg)、高(80mg/kg)剂量组5组，每组按缺血后时间又分为1、3、7、14、21d 5个亚组。线栓法制作左侧大脑中动脉阻塞模型，术后2h腹腔注射不同剂量的川芎嗪(1次/d)，至处死前2h。免疫组化染色观察脑缺血后不同时间侧脑室室下区(SVZ)、胼胝体(CC)、梗塞区周围纹状体和大脑皮质、海马CA1区及齿状回(DG) nNOS表达。结果 假手术组各脑区不同时间nNOS的表达相近，差异均无统计学意义(P>0.05)。在SVZ，模型组11

3、4d nNOS表达降低，21d 时增高；川芎嗪各剂量组均表现为314d nNOS表达明显降低，21d明显增高。在CC，模型组314d明显降低，21d有所回升；芎嗪各剂量组nNOS表达均表现为314d明显降低，以中、高剂量组降低最为明显，21d增高。在缺血周围皮质和纹状体，模型组nNOS表达均表现为3、7d明显降低，14、21d呈明显增加趋势；川芎嗪各剂量组nNOS的表达321d均较低，以中、高剂量组714d降低最为明显，21d时稍有回升。在DG、CA1区，模型组3、7d nNOS表达明显降低，14d时增高；川芎嗪各剂量组321d nNOS的表达均降低。各脑区不同时间点nNOS表达模型组与川芎嗪

4、各组间均存在明显差异(P<0.05)。结论 川芎嗪对脑缺血后314d各脑区nNOS的表达有明显抑制作用，提示川芎嗪可能通过抑制nNOS的表达、减少NO产生发挥其脑保护作用。 【关键词】  川芎嗪；脑缺血；神经元型一氧化氮合酶；室下区；胼胝体；纹状体；齿状回ABSTRACT: Objective  To observe the expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in different encephalic regions and at different time points after foca

5、l cerebral ischemia in adult rats and explore the effect of Ligustrazine on nNOS expression. Methods  SD male adult rats were randomly divided into five groups: sham operation, ischemic model, low dose (20mg/kg), medium dose (40mg/kg) and high dose (80mg/kg) Ligustrazine groups. According to th

6、e time after ischemia, each group was further divided into 5 subgroups: 1, 3, 7, 14, and 21d (3 rats in each subgroup). Middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was established by placement of an intraluminal filament at the origin of MCA. Ligustrazine was administered intraperitoneally at a da

7、ily dose of 20, 40 or 80mg/kg starting at 2h after MCAO, respectively, until 2h before sacrifice. Immunohistochemical staining was adopted to observe nNOS expression in subventricular zone (SVZ) of the lateral cerebral ventricle, corpus callosum (CC), striatum and cortex periinfarction, CA1 area, an

8、d dentate gyrus (DG). Results  Expression of nNOS at different time points was similar in sham operation group, with no significant difference (P>0.05). In SVZ, nNOS expression in ischemic model group was reduced on days 1-14, but increased on day 21; after Ligustrazine administration, nNOS

9、expression was obviously decreased on days 3-14 in all Ligustrazine dose groups, but began toincrease on day 21. In CC, nNOS expression in ischemic model group was reduced on days 3-14, and began to increase on day 21; in the differentdose Ligustrazine groups, nNOS expression was significantly decre

10、ased on days 3-14, especially in medium and highdose groups, but increased on day 21. In striatum and cortex periinfarction, nNOS expression in ischemic model group was obviously decreased on days 3 and 7, but enhanced on days 14 and 21; in variousdose Ligustrazine groups, nNOS expression was decrea

11、sed on days 3-21, especially in medium and highdose groups, but increased slightly on day 21. In DG and CA1 areas, nNOS expression in ischemic model group was reduced on days 3 and 7, but began to increase on day 14; nNOS expression in all Ligustrazine groups were decreased during 3-21d. There were

12、significant differences between ischemic model group and differentdose Ligustrazine groups at different time points (P<0.05). Conclusion  Ligustrazine has a significantly inhibitory effect on nNOS expression in different encephalic regions during 3-14d after focal cerebral ischemia, suggesti

13、ng that Ligustrazine might play a brainprotecting role by inhibiting nNOS expression and reducing NO production.KEY WORDS: Ligustrazine; cerebral ischemia; neuron NO synthase; subventricular zone (SVZ); corpus callosum (CC); striatum; dentate gyrus (DG)   在中枢神经系统中，一氧化氮(NO)是一个具有信号传递功能的

14、自由基分子，脑实质内的NO由广泛分布、表达神经元型NO合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)的特定神经元合成。胚胎发育期间，室下区nNOS的表达增加，室下区内或附近的迁移细胞表达nNOS，处于皮质神经发生高峰期的大脑皮质板和海马内，NOS活性的暂短升高与干细胞增殖的停滞和细胞分化的时间一致，提示NO在胚胎期的神经发生中起一定作用12。中枢神经系统形成时，NO的参与可能与神经元的程序性细胞死亡、轴突投射模式的形成、细胞增殖的控制、迁移和分化的调节有关。NO在个体发育的不同阶段和不同的脑区以及不同的生理病理状态下所产生的作用并不相同35。有研究显示，nNO

15、S在脑缺血后侧脑室室下区(subventricular zone，SVZ)和海马齿状回颗粒下层(subgranular zone, SGZ)区的细胞增殖、迁移和分化中发挥一定的作用。   川芎嗪(Ligustrazine, Lig)在临床上用于治疗脑梗塞疗效肯定。研究表明川芎嗪能降低脑缺血再灌注后NOS活性，对脑缺血可能产生保护作用。我们以前的研究表明，川芎嗪能促进脑缺血诱导的SVZ和SGZ内细胞的增殖和迁移68，其机制尚不清楚。为了探讨川芎嗪的作用机制，我们观察了川芎嗪对脑缺血后不同时间侧脑室室下区SVZ、胼胝体(corpus callosum, CC)、梗塞区周围纹状体

16、和大脑皮质、海马CA1区、齿状回 (dentate gyrus, DG) nNOS表达的影响。1  材料与方法1.1  材料成年雄性SD大鼠，体重220260g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。适应性饲养1周后进行实验。冰冻切片机(HM505 E, Zeiss, Germany)；图像分析仪(Q550CW, 德国莱卡公司)。兔多克隆抗nNOS抗体(1200)、山羊抗兔IgG (即用型)和SABC复合液(即用型)均购自北京中山生物技术有限公司；DAB(博士德生物工程有限公司)；盐酸川芎嗪注射液(无锡第七制药有限公司)。1.2  方法SD大鼠随机分为假手术组、缺

17、血模型组及川芎嗪低、中、高剂量组5组，每组按缺血后时间分为1、3、7、14、21d 5个亚组，每组3只大鼠。采用线栓法制作左侧大脑中动脉阻塞模型9。假手术组除不插入栓线外，其余操作步骤同缺血模型组。川芎嗪低、中、高剂量组术后2h分别腹腔注射盐酸川芎嗪注射液20、40、80mg/kg，1次/d，直至处死前2h。假手术组、缺血模型组腹腔注射等量的生理盐水。在大鼠大脑中动脉阻塞后2h，参照改良的Bedersons评分方法9进行神经功能缺失评分。选择评分大于2分者进行下一步实验。分别取各组脑缺血后1、3、7、14、21d一套切片行nNOS免疫组织化学染色。主要步骤如下：切片经充分漂洗后，加入10mL/

18、L H2O2，室温30min；10mL/L Triton X100，室温30min；加入山羊血清封闭内源性过氧化物酶，室温30min；加兔多克隆抗nNOS抗体(1200)，4冰箱过夜；Biotin标记的山羊抗兔IgG，室温2h；滴加SABC复合液，室温1h。上述各步骤之间均用0.01mol/L PBS(pH 7.4)充分漂洗3次，每次5min。DAB显色。漂洗切片，晾干、脱水、透明、封片。阴性对照除不加入兔多克隆抗nNOS抗体外，其余步骤同上。在各观察点上，每组取3只大鼠，每只大鼠取3张切片，间隔200m，在高倍镜下随机选取3个视野，应用Motic Images Advances 3.2图像分

19、析软件，测定各脑区nNOS阳性染色面积占选区面积的百分比。假手术组大鼠检测左侧半球各脑区内nNOS的阳性表达面积占选区面积的百分比。数据资料使用SPSS11.5统计软件分析。数据用均数±标准差(±s)表示，采用多因素方差分析，组间比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。2  结 果2.1  nNOS在各脑区的分布 假手术组nNOS阳性细胞主要分布于CA1区、DG、SVZ、纹状体、皮质、基底前脑和胼胝体。在CA1区nNOS阳性细胞散在分布于锥体细胞层，突起并不长(图1A)；DG nNOS阳性细胞分别位于颗粒细胞层、颗粒下层及门区，以颗粒细胞下层偏多(图1B)；SVZ区的nNOS阳性细胞胞体位于SVZ外，其长的突起并不穿越SVZ和室管膜层(图1C)；纹状体nNOS阳性细胞较多，并发出长的突起连接成网(图1D)；皮质nNOS阳性细胞相对较少，散在分布，发出长的突起(图1E)；基底前脑分布较多nNOS阳性细胞，但突起较短(图1F)；胼胝体的nNOS阳性细胞散在分布，可见胞体及突起(图1G)。2.2  各组脑缺血后SVZ nNOS的表达 脑缺血后nNOS阳性细胞的胞体位于SVZ外，其长的突起并不穿越SVZ和室管膜层，类似于假手术组。假手术组121d nNOS的表达相近，差异无统计学意义(P&