国内外单克隆抗体技术最新研究进展

1、国内外单克隆抗体技术最新研究进展 国内外单克隆抗体技术最新研究进展 系 别: 生物工程系 学生姓名: 专业班级: 生物技术及应用(2)班 学 号:20084310219 指导教师: 年月日 摘要 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。 1975年Kohler和Milstein首先报道,用细胞杂交技术,使经绵羊红细胞SRBC免疫的小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞融合,创建了第一个B细胞杂交瘤细胞株,获得了抗SRBC的单克隆抗体。这是免疫学,乃至医学史上的一个里

2、程碑。 单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。快速制备高亲合力的单克隆抗体,改进常规方法制备单抗费时费力且亲合力低的弱点,对后基因时代蛋白质组学等基础研究领域的研究具有巨大的推动作用。同时在生物芯片、临床医学和疾病的诊断与治疗以及空间生命科学等应用领域有着广阔的应用前景。 关键词:单克隆抗体;研究进展 目 录摘要?(3)1 概述62 单克隆抗体的诞生、发展63 单克隆抗体的研究73.1单克隆抗体的概念73.2 单克隆抗体技术的基本原理74动物免疫94.1抗原制备94.2免疫程序的确定104.3免疫动物的选择114.4细胞免疫的方法制备

3、单抗134.5多位点重复免疫制备单抗145 单克隆抗体人源化研究进展155.1嵌合抗体165.2 表面重塑165.3 重构抗体175.4抗原结合位点的重构175.5 链替换185.6 噬菌体表达技术185.7 转基因动物185.8 人单抗与鼠单抗的比较196 单克隆抗体表达系统的研究206.1 微生物表达系统206.1.1 大肠杆菌表达系统206.1.2 低等真核微生物表达系统216.2 哺乳动物表达系统216.2.1 DNA转移和整合216.2.2 宿主细胞改造226.3 植物细胞表达系统226.4 其他表达系统226.4.1 病毒展示系统226.4.2 酵母展示系统226.4.3 细菌展示

4、系统237 综述23参考文献24 1 概述 众所周知,抗体是由浆细胞分泌的,浆细胞又是由B淋巴细胞转化而来,每个B淋巴细胞株制造它的专有抗体,每株细胞系只能产生一种它专有的、针对一种它能识别的特异性抗原决定簇的抗体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体(McAb,简称单抗)。但这种细胞不可能在体外长期生长繁殖。为解决这一难题,Kohler和Millstein于l975年首次建立了杂交瘤技术。 目前,产生各种特异性鼠单抗的杂交瘤细胞株已经建立,并有许多细胞株成为良好的生产种细胞。除B淋巴细胞杂交瘤外,具有多种T淋巴细胞功能的T细胞杂交瘤和T-B细胞杂交瘤亦已经建立起来。由于单抗的应用是从

5、体外诊断向体内肿瘤定位和治疗方向发展,故鼠源性单抗出现了难以克服的缺点,特别是在体内应用时,存在主要组织相容性抗原 MHCI1超敏反应问题,因此现在的单抗已向人源化方向发展。1980年人-人B淋巴细胞杂交瘤融台成功,1981年又成功融合了具有抑制功能的人T淋巴细胞杂交瘤。这些研究成果为现代生物技术制药开辟了广阔的前累。2 单克隆抗体的诞生、发展 第一代单抗诞生于1975年,来源于小鼠的B细胞杂交瘤,称为鼠源性单抗。人的免疫系统可以识别鼠源性单抗,产生人抗鼠抗体(HAMAs),将其清除出体外,因此限制了它的应用。随后研究人员采用基因工程的方法生产人源或人源化的单抗以及嵌合型的单抗,特别是在198

6、4年报道研究出了人-鼠杂交瘤的构建方法,在1987年进行了第一次临床试验。基于一种单抗中人源的部分越多其疗效越高的假设,人源化单抗于1986年开始生产,并于1988年进行了第一次商业性的临床试验。 根据用途的不同,单抗大体上可分为三类,即诊断用单抗(如肝炎化验用单抗等)、治疗用单抗、“生物导弹”用单抗。单抗为人类疾病的防治和诊断、肿瘤体内定位、靶向药物的制备、防止移植物的排异反应、新型疫苗的研制提供了较为理想的手段。3 单克隆抗体的研究3.1单克隆抗体的概念 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系,每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随

7、机重排只产生识别一个抗原受体基因,重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时,抗原分子上的许多决定簇分别即或各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞(浆细胞)和记忆B细胞,大量的浆细胞可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群,即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体,称为单克隆抗体(Monoclonalantibody,简称McAb)。3.2 单克隆抗体技术的基本原理 所谓的单克隆抗体是指由单一克隆杂交瘤细胞产生的只识别某一特定抗原表位的同源抗体。 单克隆抗体是经过人工制备的一类特殊抗体,它具有一般抗体的性质;它是B细胞增殖分化为浆细胞所产

8、生的一类球蛋白,存在于体液中,具有免疫功能 ,介导体液免疫;它能与相应抗原如病原体特异性结合,在其他免疫分子和细胞的参入下发挥免疫效应 ?单克隆抗体的本质是球蛋白,具有球蛋白的理化性质,空间结构和生物学活性.球蛋白对热和化学物质敏感,加热和加入化学试剂易破坏其结构,具有一定的半衰期.它和球蛋白一样具有可变区和恒定区,可变区结合抗原,形成抗原抗体复合物;恒定区有补体结合位点,介导补体发挥作用,形成攻膜复合物,杀伤变异的细胞. 要制备单克隆抗体需要先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞,但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖,应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴

9、细胞二者合二为一,得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性,它既具有B淋巴细胞合成专一性,也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性,用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群。可制备一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成。 实验证明用某些原核表达蛋白免疫动物制备的抗血清只能与变性蛋白反应,而不能结合天然抗原,这一现象在用杆状病毒表达的蛋白中也存在。尽管这类抗体能用于Western Blot实验,但研究天然蛋白的结构与功能则受到很大的限制。而用真核表达系统如酵母、昆虫和哺乳

10、类动物细胞表达蛋白质,存在着实验周期更长、表达产量更低、技术难度更大等问题。 另一方面,体内生产单抗的方法是腹水诱导法。该法简便、成本低、抗体浓度高、产量大,因而长期取代体外培养,为实验室所普遍采用。在小鼠腹腔,杂交瘤细胞密度近似于实体组织,约1091010个/ cm3,抗体质量浓度较高,可达110 g/ L,无支原体污染,只混有少量小鼠蛋白,可以接种不同数量的小鼠以满足不同的单抗需要量。此法生产单抗纯度高、生产成本低、周期短,不需要昂贵的设备,因此,长期以来被广泛采用。但是,腹水诱导法也存在一些不利因素,如混杂有小鼠免疫球蛋白、具有反应活性的细胞因子及病原因子、批与批之间单抗特异性不稳定,加

11、上人道主义原因,芬兰与德国已禁止使用该技术,美国、英国、瑞士、加拿大等国也加强了对该技术使用的限制。许多研究者开始转向体外单抗生产技术的开发,并建立了许多用于不同规模的生产技术。 现代分子生物学和免疫学技术使人们可以采取多种手段克服以上不足,其中最有前景的方法就是DNA 免疫、细胞免疫。4动物免疫4.1抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原,从纯度上说虽不要求很高,但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加,同时可以减轻筛选的工作量。因此,免疫免疫抗原是越纯越好,应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说,抗原的来源有限,或性质不稳定,提纯时易变性,或其原性很强,或所需单抗是用于抗原不同组分的纯

12、化或分析等,免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯,但抗原中混杂物很多,特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时,则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同,也可是不同的纯度,这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。4.2免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一,其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖,以利于细胞融合形成杂交细胞,并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。 DNA 免疫的机理:第一步是成功地转染细胞,被吸收的质粒在哺乳动物强启动子作用下,合成mRNA ,进而合成免疫原性蛋白。第二步则是从该类细胞将目的蛋白转移到抗原提呈细胞antigenpres

13、ent cell APC。目前提出两种机制:肌细胞分泌蛋白该假设已经得到证实;细胞死亡后APC获取蛋白如通过凋亡。第三步是APC 呈递蛋白至类或类主要组织相容性复合物major histo2compatibility complex,MHC途径。 目前,运用DNA 免疫的方法,已成功制备了生长激素、flt3、凝血因子IX、INF2和血型抗原等,病原微生物如:prion、Helicobacter pylori 和HIV ,膜分子G蛋白偶连受体等的单克隆抗体。最近Li等采用肌肉组织特异性的启动子来进一步提高DNA 免疫的效果,其基本思想是构建含肌肉组织特异启动子DNA 免疫载体,使抗体的亲合力增加

14、了10 倍。因此,在目的基因前加上肌肉组织特异的启动子或改构表达载体上的调控序列,可提高DNA 免疫抗体的亲合力。 DNA 免疫制备单克隆抗体除了快速,简便,高产,高效外。由于基因操作简单,对免疫原性较弱的蛋白,通过与免疫原性较强的蛋白构建融合基因载体进行免疫,如HIV 的外壳基因Env 和补体成分C3d DNA疫苗表达融合蛋白可增强HIV 外壳蛋白抗体的亲合力成熟;同时也可以构建含有多种蛋白的融合基因载体进行免疫,产生针对不同蛋白的单克隆抗体。因此,DNA 免疫的研究越来越受到关注,其应用也越来越广泛。4.3免疫动物的选择 根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为,所有的供杂交

15、瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠,所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠,所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是,有时为了特殊目的而需进行种间杂交,则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定,因为染色体容易丢失。就小鼠而言,初次免疫时以8-12周龄为宜,雌性鼠较便于操作。 在设计免疫程序时,考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能使用于各种抗原。 现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。 免疫途径常用体内免疫法包括皮下注

16、射、腹腔或静脉注射,也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射,目前尤其推崇后者,因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好,许多实验室的结果表明,初次免疫和再次免疫应答反应中,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合,特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天,在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体,再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系,且多在血清抗体高峰之前。 因此,为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞,这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。

17、已有人报道采用脾内免疫,可提高小鼠对抗原的免疫反应性,且节省时间,一般免疫3天后即可融合。 体内免疫法使用于免疫原性强、来源充分的抗原,对于免疫原性很弱或对机体有害(如引起免疫抑制)的抗原就不适用了。如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免疫法。 因此,针对这些情况,可采用体外免疫。所谓体外免疫就是将脾细胞(或淋巴结细胞,或外周淋巴细胞)取出体外,在一定条件下与抗原共同培养,然后再与骨髓瘤细胞进行融合。其基本方法是取4-8周龄BALB/c小鼠的脾脏,制成单细胞悬液,用无血清培养液洗涤2-3次,然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中,再加入适量抗原(可溶性抗原0.5-5ug/ml,细胞抗原105

18、ml)和一定量的BALB/c小鼠胸腺细胞培养上清液;在37,6%CO2浓度下培养3-5天,再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。表6-1 不同免疫抗原的免疫程序免疫原特性抗原量接种次数间隔时间单抗的特性抗体滴度亲和性免疫原性强(如细胞、细菌和病毒等)106-107个细胞或1-10ug2-42-4周高中等至强免疫原性中等10-100ug2-42-4周中等或高中等或强免疫原性弱A.20-400ug2-4随后2-3每月2-3月中等强B.10-50ug其后200-400ug2其后4每月每天中等中等C.10-100ug2其后4其后“休息”最后加强每月10天1-2月中等中等或强4.4细胞免疫的方法制备单抗 基本原

19、理就是利用糖基磷脂酰肌醇(GPI )锚蛋白能锚定在细胞膜表面的特点,用目的基因替代天然GPI 锚定蛋白基因的3末端,构建真核表达载体后转染细胞,目的蛋白能表达在细胞膜表面,该细胞免疫小鼠后会产生针对外源基因蛋白的特异性抗体,然后用流式细胞仪筛选细胞膜表面高表达外源蛋白的细胞,用于筛选产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 但由于细胞膜表面有大量的膜表面分子,机体会同时产生针对这些分子的抗体,所以GPI 的方法的应用有一定的局限性。利用消减免疫 subt ractive immu2nization ,SI 改良该方法,即先用未转染的细胞免疫小鼠一段时间后,然后给小鼠注射免疫抑制剂环磷酰胺cyclopho

20、sphamide,这样就可以抑制机体产生针对细胞膜表面分子的抗体,然后用转染细胞进行免疫,这样,小鼠体内主要产生针对目的基因蛋白的抗体。SI 在用细胞和蛋白免疫制备单克隆抗体的过程中,取得了理想的结果。4.5多位点重复免疫制备单抗 Kilpat rick 和Bynum等报道了另一种免疫技术。他们在蛋白免疫、DNA 免疫和细胞免疫的基础上,结合多位点重复免疫 repetitive immunizations multiple sites,RIMMS 技术,大大缩短了制备单克隆抗体的时间,将抗原或DNA 免疫713 d 的小鼠引流淋巴结细胞与稳定转染Bcl22基因的瘤细胞融合,成功地制备了针对免疫

21、原高亲合力的单克隆抗体。 RIMMS 技术原理: RIMMS技术原理:T细胞依赖的B细胞反应的成熟与次级淋巴组织中发育的动态微环境?生发中心(GC)的形成有关。树突状细胞(DC)从抗原递呈位点摄取和传递抗原,在区域淋巴结内立即引起T细胞依赖的B细胞反应。免疫后3-5d,抗原致敏的T细胞、B细胞与APC识别性相互作用,导致GC的形成。GC中由于B细胞扩增并经历抗原驱使的成熟和选择过程,抗原特异性的免疫球蛋白的所有组分得以发育。GC的形成、扩增和缩小大约在免疫后16d内完成,诱发抗原特异性的末端浆细胞和记忆细胞的产生。GC的暗区(DZ)内中央胚细胞的体细胞超突变期间V区免疫球蛋白基因内发生点突变,

22、导致抗原免疫后710d形成亲和力成熟的免疫球蛋白。抗原特异性中央细胞的选择发生在GC的明区(LZ),这一过程与滤泡树突状细胞(FDC)和T辅助细胞的识别和非识别信号传导有关。表现抗原特异性、亲和力成熟sig的中央细胞进一步分化成熟的记忆细胞或末端浆细胞,而那些未被选择的B细胞重新进入DZ并经历进一步的体细胞突变和选择过程。 同常规方法制备单克隆抗体相比,RIMMS 有很多优点: 采用RIMMS 方法制备高亲合力的mAbs 仅需要12 只小鼠和少量的抗原400 ng3g/ 位点 或DNA 2.5100g/ 位点 ; RIMMS还免除了免疫过程中试血过程。迄今为止,已经建立了快速制备包括合成肽、重

23、组蛋白、细胞提取物、连接复合物以及体内DNA 免疫后表达蛋白等多种免疫原mAbs 的方法,并广泛用于EL ISA、免疫沉淀、竞争性联结、免疫印渍分析、免疫细胞化学或免疫组化等方面的研究。将消减免疫、RIMMS 的方法与DNA免疫和细胞免疫的方法相结合,建立一种快速制备高亲合力抗体的实验方法,将大大缩短单抗制备的周期,对蛋白组学和蛋白质芯片的研究有巨大的推动作用。5 单克隆抗体人源化研究进展 最早的单克隆抗体是从小鼠获得的,为人体抗小鼠抗体(HAMA),随着抗体工程技术的发展。一些嵌入式或拟人化的单克隆抗体产品已获得批准,有可能是所有的单克隆抗体人源化,并可降低免疫排斥反应的危险性。 虽然鼠源单

24、抗能特异识别抗原,但在人体中常不能有效激活补体和Fc受体相关的效应系统;再次,外源抗体在人体循环系统中很快被清除。因此,根据抗体结构与功能之间的联系,在保持原单抗对特异抗原表位的高亲和力的基础上对其进行体外人源化改造,减少异源抗体的免疫原性成为改进单抗治疗的重点。目前报道的人源化方法主要有:嵌合、表面重塑 resurfacing、重构 reshaping 以及链替换chain shuffling。5.1嵌合抗体 Mo rrison 等从杂交瘤细胞中获得抗体V 区cDNA ,克隆到重组了人抗体C 区的载体中,转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体。改造后的抗体保留了原单抗特异结合抗原的V 区,去除了

25、非人源序列C 区 ; 但由于其整个V 区都是异源的,所以嵌合抗体的异源性还很明显,解决HAMA 的效果并不理想。嵌合抗体完整地保留了异源单抗的V 区,最大限度地保持了其亲和活性,可作进一步改造的亲和力参照体,也是进一步提高补体活化及细胞毒作用等的基础对照。5.2 表面重塑 通常认为,抗原上的抗原决定簇应具残基的运动性和溶剂的可及性,多集中在抗原表面,因此可推测异源抗体在人体内引起免疫反应的主要抗原决定簇应是该抗体的表面上溶液可及的残基。5.3 重构抗体 重构抗体是由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建的。表面重塑是对鼠抗体表面氨基酸残基surface amino acid res

26、idues,SAR 进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR 差别明显的区域,在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换;另外,所替换的区段不应过多,对于影响侧链大小、电荷、疏水性,或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区complementary determinant region,CDR 构象的残基尽量不替换。但也有相反的理论认为,内部的残基会因为抗原在递呈过程中的加工暴露出来,表现出免疫原性。虽然如此至今还没有表面重塑的人源化抗体在体内实验中引起HAMA的报道。5.4抗原结合位点的重构 CDR 移植该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法,很多CDR

27、 移植抗体在临床实验中取得了较好效果。SDR 转移用X 射线晶体衍射检测不同物种抗体与抗原结合的特征后,发现并不是整个CDR 都参与与抗原的特异性识别、结合,而是由一些特定的区域特定决定区,SDR 执行该功能,据此提出了SDR 转移法:将异源抗体中与抗原结合密切相关的SDR 等少数残基移植到人抗体相应位置上。5.5 链替换 实验发现一些抗体中轻、重链V 区在结合抗原中起的作用不同,对于作用较弱的链进行链替换,同样可以获得高亲和力的抗体。应用重链链替换Park 等成功地人源化抗乙型肝炎病毒HBV 前S1 的单抗,所得抗体保持了抗体活性,同时免疫原性明显降低。5.6 噬菌体表达技术 这是利用噬菌体

28、表面表达人体功能性抗体片段技术。目前数据库已经拥有1000亿个从体外得到的各种抗体,可以迅速地筛选出各种抗原,具有较高亲和力的抗体。这些抗体可以用遗传工程的方法开发出人源化抗体产品。 英国剑桥抗体技术公司是这方面的先驱。噬菌体表达方法除了能得到完全人源化的答克隆抗体外,主要特点是加快了抗体筛选的速度,用传统免疫方法得到的小鼠答克隆抗体耗时8周到半年,现在不到1星期。5.7 转基因动物 转基因动物的发展也很快,已经从转基因小鼠发展到了转基因羊和转基因牛等。单克隆抗体领域的应用是用动物得到完全人源化的单克隆抗体。由于转基因小鼠已经有了人类抗体基因,所以在用异体抗原免疫时,可以得到人类抗体。美国已经

29、有了两家公司得到了小鼠的转基因株,他们分别是Abgenix和Medarex公司。 现在抗体研究已经进入了收获阶段,已经有了9个人源化单克隆抗体产品。致力于人源化单克隆抗体开发的企业已有250家,正在开发中的产品有700多个,其中100多个已经进入临床研究,单克隆抗体药物约占所有在开发的生物技术药品的25%左右。5.8 人单抗与鼠单抗的比较 人单抗与鼠单抗相比,具有以下有点: 1人单抗特异性鞍强: 2MHC单抗,可以对人类MHC的结构和功能进行分析;3因是同塬性免疫球蛋白,故应用于人体,不易发生过敏反应及免疫复合性疾病; 4在人体内维持时间较长; 5可制备用于人的抗独特型抗体。 上述特点使得人单

30、抗为人类疾病防治和论断、肿瘤体内定位.靶向药物制备、防止移植物排斥反应、新型疫苗研制,提供了较为理想的手段。最近,嗜菌体表达技术和转基因动物技术等的发展,有可能使所有的单抗人源化,降低免疫排斥反应的危险性。 由于人源单抗的制备具有建株的困难、Ig产量低、稳定性和亲和力差等难点,且一直缺乏有效的解决办法。近年来基因工程技术的发展,为鼠一人嵌合单抗的制备开创了新的途径。利用淋巴细胞杂交瘤技术建立分体特异性单抗杂交瘤细胞系,从中提取已重排的编码功能性IgDNA基因组组建DNA文库或成熟的Ig H/L链mRNA片段组建cDNA文库及制备探针,从而获得编码特异性单抗的V区基因;利用DNA重组技术,将此来

31、源于小鼠特异性Ig H.L链的C区基因组重组,构建鼠一人嵌台的Ig重组基因:然后将此重组嵌鲁的Ig基因导人真核表达质粒多为pSVz-ypt和pSVz-neo;经磷酸钙沉淀技术、原生质体融舍技术或电穿孔导人技术,将此质粒转染哺乳动物非分泌型骨髓瘤细胞,经选择性培养基培养,从中筛选分泌完整功能性鼠一人嵌台单抗。6 单克隆抗体表达系统的研究6.1 微生物表达系统6.1.1 大肠杆菌表达系统 对大肠杆菌表达系统的优化主要集中在以下几个方面:a通过突变将稀有密码子替换为大肠杆菌的常用密码子,相当于提高转运RNA的相对浓度,进而提高翻译效率;b通过CDR嫁接将不溶性scFv片段的接触残基嫁接到表达好且稳定

32、的scFv片断支架上,提高可溶性产物的表达和重组分子的热稳定性;C与抗体片断同时表达分子伴侣和折叠酶,有研究表明大肠杆菌中分子伴侣过量表达可提高可溶性功能蛋白质的产量;d使抗体片断和其他蛋白质形成融合蛋白以方便纯化及减少不溶性重组抗体包涵体的形成。此外,还可利用弱启动子和降低环境温度以降低产物的合成速率,减少包涵体形成。6.1.2 低等真核微生物表达系统 作为另一种微生物表达系统,利用酵母和丝状真菌生产重组抗体或抗体片断同样有生产周期短的优势,且这些细胞可在廉价的培养基上培养到100g/L的高密度,相比哺乳动物细胞系统有更大的生产力,被用于生产由于错误折叠或要求糖基化而不能利用大肠杆菌合成的抗

33、体或其他蛋白产物。6.2 哺乳动物表达系统 尽管原核表达系统正在朝着有利于人类的方向被优化,哺乳动物表达系统在重组抗体或抗体片段的生产方面仍然占据主导地位。哺乳动物细胞系统有一套较成熟的生产路线:首先重组基因被转人细胞,其次第二个基因也被转入细胞,该基因的作用是使受体细胞获得选择优势,在某种选择试剂存在下,只有表达了该选择基因的细胞能够存活。最常用的选择基因编码二氢叶酸还原酶DHFR一参与核苷酸代谢,和谷胺酰胺合成酶GS目前该系统提高产量的优化措施主要是改进载体、宿主细胞改造、优化培养基及筛选方法和过程改造等。6.2.1 DNA转移和整合 目前,依赖于非病毒的基因转移仍是产生稳定细胞系的主要方

34、法,如磷酸钙转染法、电穿孔、脂质体转染法、基因枪法和多聚物介导的基因转移,但具体哪一种方法更有优势不得而知,因为尚缺乏综合研究。6.2.2 宿主细胞改造 该方向主要着眼于提高蛋白质翻译后修饰和加工系统。此外,细胞系的改造还包括提高对影响存活率的因素的抵抗力及携带生长促进基因。3细胞选择。选择试剂selection agent最关键的考虑因素是选择力或严谨度,高严谨度的试剂可以更有效的选择表达重组基因及选择基因的细胞。6.3 植物细胞表达系统 植物细胞表达系统提高产量的措施包括改善表达载体的基因调控元件,如启动子和多聚腺苷酸位点,移除不理想的序列或将稀有密码子替换为常用密码子,优化产物亚细胞结构

35、的定位,及解决植物和人糖基化系统差异问题等等。6.4 其他表达系统6.4.1 病毒展示系统 通过改造病毒基因组或噬质粒将重组抗体基因和病毒外被蛋白基因融合,这些外壳蛋白基因负责噬菌体的侵染和组装,因此与之连接的重组抗体会同时被展示在病毒表面,进而再通过亲和富集法筛选表达有特异性蛋白质的病毒,最终获得具有特异结合性质的产物。6.4.2 酵母展示系统 该技术同样通过将目的蛋白基因与酵母基因融合使蛋白质在细胞表面展示,与噬菌体系统不同的是,酵母由于体积大,因此可以用流式细胞仪筛选,这方便了具有不同特异亲和力抗体的分离。6.4.3 细菌展示系统 该技术基本原理仍与其它展示技术类似,一种方法是依赖于革兰

36、式阴性细菌分泌的自运输体autotransporter,该蛋白C端有一结构域可插入细菌的外膜并组装成2rim的亲水通道,蛋白质的N端可通过此寡聚物通道运输到细胞外,若将该N端结构域替换为不同的scFv片段或VHH结构域,稳定的scFv和VHH片段可以接近100%的效率被展示在细菌细胞表面。此外,还有若干无细胞表达系统被报道,如RNA一肽融合展示系统,核糖体展示系统等7 综述 近年来单克隆抗体生产技术的发展使抗体表达平台扩展到基于微生物、真菌、植物和哺乳动物细胞等表达系统方向,值得一提的是抗体工程通过根据需要改造宿主细胞极有效的提高产量、延长抗体寿命、优化表达后修饰,如对大肠杆菌、真菌、植物细胞

37、糖基化途径的改造一定程度上可缓解这些生物与人糖基化途径不同的问题,又如对哺乳动物细胞代谢途径的改造一方面可提高蛋白产量,一方面改善抗体亲和力等性能。目前,如何同时最优化抗体产量、特性并选择最合适的表达系统仍是该领域的热点和困难,相信不久的将来,随着重组DNA等分子生物学技术的进一步发展,这些困难可以得到解决。 参考文献1 周珍辉 主编动物细胞培养技术 中国环境出版社 2006年8月第一版第一次印刷。188-2412 Mann MJ ,Gibbons GH ,Hutchinson H ,et al 。Pressure2medi2ated oligonucleotide transfection

38、of rat and human cardiovascu2lar tissuesJ 。Proc Natl Acad Sci USA ,1999 ,96 11 :64112-6416.3 Rizzuto G,Cappelletti M ,Maione D,et al 。Efficient and reg2ulated erythropoietin production by naked DNA injection andmuscle electroporationJ 。Proc Natl Acad Sci USA ,1999 ,96 11 :641726422.4 Ulmer JB ,DeWit

39、t CM ,Chastain M ,et al 。Enhancement of DNA vaccine potency using conventional aluminum adjuvants J 。Vaccine 1999 ,18 1 - 2 :1828.5 Singh M ,Briones M ,Ott G,et al 。Cationic microparticles : apotent delivery system for DNA vaccinesJ 。Proc Natl Acad Sci USA ,2000 ,97 2 :8112816.6 Briones M ,Singh M ,Ugozzoli M ,et al 。The preparation ,characterization ,and valuation of cationic microparticles for DNA vaccine delivery J 。Pharmaceutical Research ,2001 ,18 5 :7092722.7 林清华 主编 免疫学实验 武汉大学出版社 2004年1月