基于川芎嗪预处理对心肌细胞缺血再灌注损伤延迟保护作用分析

1、基于川芎嗪预处理对心肌细胞缺血/再灌注损伤延迟保护作用分析         你正在浏览的临床医学论文是基于川芎嗪预处理对心肌细胞缺血/再灌注损伤延迟保护作用分析                    【摘要】 目的 探讨川芎嗪预处理对心肌缺血/再灌注损伤延迟保护作用。方法 实验用SD新生(13 d)大鼠，雌雄不拘，无菌

2、取出乳鼠心脏，经分离附着组织、胰蛋白酶消化及纯化制成心肌细胞培养，第4 天随机分为4组：正常对照(Control)组、缺氧/复氧(A/R)组、缺氧预处理(APC)组、川芎嗪(TMPZ)组。观察心肌细胞搏动频率、细胞存活率(MTT法)、培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性。结果 细胞搏动频率：缺氧/复氧组(13±3 )次/min，与正常对照组相比差异有显著性(P<0.05);APC组(84±6) 次/min，TMPZ组(85±3)次/min，对正常心肌细胞搏动频率无明显影响(P>0.05)，与缺氧/复氧组比较差异有显著性(P<0.05);APC组、TM

3、PZ组之间差异无显著性(P>0.05);细胞存活率： 缺氧/复氧组(36.23±4.05)%，与正常对照组比较，差异有显著性(P<0.05);APC组(83.76±6.92)%，TMPZ组(80.56±4.65)%分别与缺氧/复氧组比较，差异有显著性(P<0.05)，APC组、TMPZ组之间差异无显著性(P>0.05);LDH活性： 缺氧/复氧组(36.73±2.35) U/L与正常对照组比较，差异有显著性(P<0.05);APC组(5.70±0.63 ) U/L、TMPZ组(5.74±0.34) U/L

4、，分别与缺氧/复氧组比较，差异有显著性(P<0.05)，APC组、TMPZ组之间差异无显著性(P>0.05)。结论 从细胞水平证实TMPZ预处理后24 h心肌细胞对再次缺氧/复氧损伤具有保护作用。        【关键词】 缺氧/复氧损伤;缺氧预适应;延迟保护;川芎嗪        Abstract:Objective To investigate the delayed myocardioprotection of TMP

5、Z pre- conditioning. Methods Cultured myocardial cells of neonatal SD rats have been randomly divided into 4 groups: Control group; anoxia reoxygenation (A/R)group;anoxia preconditioning group(APC); TMPZ group; In each group, the cardiomyocytes were subjected to anoxia (3 hr) followed by reoxygenati

6、on (1 hr) 24 hr after anoxic (or TMPZ) preconditioning on the model of the cultured cardiomyocytes. At the end of experiment, myocardial cells beating rate, cell viability and the activity of LDH in culture were measured. Results Beating rate of ventricular myocytes: The beating rate was significant

7、ly slow in A/R group(13±3 beats/min) compared with that of control group(P<0.05); Between APC group(84±6 beats/min) and TMPZ group (85±3) beats/min, the beating rate was similar to each other(P>0.05),and compared with A/R , the beating rate was significantly increased(P<0.05)

8、;the cell viability:The cell viability of A/R(36.23±4.05)% was significantly decreased when compared with that of control group(P<0.05); the viability of APC (83.76±6.92)% ,TMPZ (80.56±4.65)% was significantly increased when compared with A/R respectively，(P<0.05),between APC an

9、d TMPZ, the cell viability was similar to each other(P>0.05);LDH activity: LDH activity of A/R (36.73±2.35 ) U/L was significantly increased when compared with Control group(P<0.05); LDH activity of APC(5.70±0.63 )U/L or TMPZ (5.74±0.34 ) U/L was significantly decreased when com

10、pared with A/R respectively (P<0.05),but LDH activity of TMPZ was similar to that of APC group(P>0.05).Conclusion TMPZ preconditioning can mimic the delayed protection on cultured neonatal rat myocardiocytes with hypoxia/reperfusion injury.        Key wo

11、rds: anoxia/reoxygenation; anoxia preconditioning; delayed protection; TMPZ        心肌缺血预适应(ischemic precoditioning，IPC)指一次或几次短暂反复心肌缺血再灌注可使心肌在此后的持续缺血再灌注损伤中得到保护1。这一概念自1986年Murry等提出后，即为缺血心肌的保护及其机制的探索开辟一个新的领域，成为许多学者专家研究的热点。根据保护效应出现的时间，IPC被分为早期(early phase,EP)和延迟期(

12、delayed    phase,DP)2个阶段2。EP发生于缺血后数分钟,持续23 h;DP于缺血1224 h后出现、持续34 d。由于DP的持续时间长便于利用,成了临床和实验研究的重点。研究者们期望发现此类药物或识别DP中合成的内源性保护蛋白，拟在临床有效地应用IPC。川芎嗪是中药川芎的主要生物碱，其化学结构是四甲基吡嗪(trtramethylpyrazine, TMPZ)。本研究在原代培养心肌细胞缺氧/复氧损伤及缺氧预处理模型上,观察缺氧预处理后24 h对缺氧/复氧损伤的延迟保护作用。     &#

13、160;  1材料与方法        1.1实验动物        由江西医学院医学实验动物科学部提供的SD大鼠的乳鼠(13 d)，雌雄不限,合格证号0219602。        1.2主要试剂        5Br2deoxyuridine (BrdU)

14、: Sigma公司产品;MEM培养基：GIBCO BRL公司产品;4(2hydroxyethyl)1piperazine ethanesulfonic acid (HEPES): Sigma公司产品;胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司产品;川芎嗪粉剂：中国药品生物制品检定所提供，生产批号：001026;青霉素钠盐：江西东风药业有限公司产品;链霉素：华美生物有限公司产品。        1.3实验主要仪器和设备        超净工

15、作台：苏州净化设备厂;二氧化碳培养箱:长沙长锦应用技术研究所;全自动生化分析仪:美国Beckman公司。        1.4方法        取2025只出生13 d的SD乳鼠的心肌细胞进行无菌分离、纯化、培养，参照Spector3等的方法略加改进。将培养第4 天的原代心肌细胞随机分4组：正常对照(Control)组、缺氧/复氧(A/R)组、缺氧预处理(APC)组、川芎嗪(TMPZ终溶度为100 mol/L)组;每组重复8次进行缺氧

16、预处理、TMPZ预处理和缺氧复氧实验。实验结束后于倒置显微镜观察并计数单位时间内各组心肌细胞搏动的频率;采取MTT比色法检测心肌细胞存活率，美国Beckman生化自动分析仪测定LDH活性。        1.5统计分析        采用统计软件SAS8.0进行方差齐性检验、方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有显著性。        2结 果

17、        2.1各处理组心肌细胞缺氧复氧损伤后细胞搏动的变化        正常对照组心肌细胞搏动频率(99±3)次·min-1相对恒定，节律规则;与正常对照组相比，缺氧/复氧组(13±3)次·min-1差异有显著性(P<0.05)，表现为搏动频率减慢、搏动幅度减弱、节律不齐，有部分停搏，部分细胞搏动幅度强弱不等;而正常对照组与APC组(84±6)次·min-1、T

18、MPZ(85±        3)次·min-1组相比，两组心肌细胞搏动频率差异均有显著性(P<0.05);APC组与TMPZ组之间差异无显著性(P>0.05),见表1。        2.2处理组的心肌细胞缺氧复氧损伤后细胞存活率的变化        缺氧/复氧组心肌细胞严重受损，细胞存活率较正常对照组降低52.79%(P&

19、lt;0.05 );APC组、TMPZ组之间差异无显著性(P>0.05);APC组、TMPZ与缺氧/复氧组相比细胞存活率分别升高47.53%和44.32%(P<0.05)，见表1。        2.3各组心肌细胞缺氧/复氧组损伤后心肌细胞悬液中LDH活性的影响        缺氧/复氧组(36.73±2.35) U·L-1细胞悬液中LDH增加10倍(P<0.05); APC组(5.70±

20、0.63) U·L-1、TMPZ组(5.74±0.34) U·L-1与缺氧/复氧组比较细胞悬液中的LDH活性均低(P<0.05);而APC组、TMPZ组之间差异无显著性(P>0.05)，见表1。        表1缺氧/复氧组与其他各处理组心肌细胞搏动频率的变化    略        3讨 论     &

21、#160;  Yamashita 4 等1992 年首次在犬的试验中发现了IPC后24 h再度出现心肌保护现象，随后预处理的延迟保护作用在鼠5、猪6等哺乳动物中获得证实。由于DP保护作用广、持续时间长具有更大的临床应用价值。近年兴起的心肌保护的热门课题通过药物激发机体内源性物质(腺苷、缓激肽、降钙素基因相关肽、PGI2、NO等)的产生或用药物模拟机体内源性物质从而启动IPC，达到保护心脏的作用。药物预处理研究取得了一定的进展，但迄今为止尚未发现理想的预处理药物。目前预处理药物主要有化学合成药物和中药两类。在众多的化学合成药物中有腺苷受体激动剂、PKC活性诱导剂、KATP+通

22、道促开放剂等，因存在产生耐受性，具有明显的致癌性5和选择性低产生多种不良反应6的缺点而无法推广应用;中你正在浏览的临床医学论文是基于川芎嗪预处理对心肌细胞缺血/再灌注损伤延迟保护作用分析            医是我国的传统医学，中药具有效果明显，毒副作用小，价格低廉等优点，成为心肌保护预处理的热点。        川芎嗪是中药川芎的主要有效成份，已有研究表明TMPZ具有抑制血小板聚集、抑制钙通道

23、、影响NOS基因表达、扩张冠状动脉，对抗心肌缺血再灌注损伤的作用7-9。心肌缺血再灌注(MIR)可诱导终末分化的心肌细胞高表达FOS蛋白及发生细胞凋亡，应用TMPZ可使缺血心肌细胞cfos基本表达减弱及凋亡减轻10,表明TMPZ对MIR诱导的缺血心肌FOS蛋白的表达及MIR导致的细胞凋亡的发生有一定的抑制作用。本实验在原代培养大鼠心肌细胞的缺氧/复氧组模型上，用TMPZ预处理24 h和IPC比较，观察TMPZ是否与IPC一样能对抗其后的缺氧/复氧组损伤。结果表明，各处理组进行缺氧/复氧组损伤后，只有缺氧/复氧组的细胞搏动频率减慢、搏动幅度减弱、节律不齐，有部分停搏等，细胞存活率显著降低，LDH

24、显著升高，而TMPZ预处理组均能明显提高缺氧/复氧组损伤后细胞搏动频率、细胞存活率，减少LDH的漏出，能达到与IPC的效果，证实TMPZ有对抗缺氧/复氧组造成心肌细胞损伤的IPC保护作用。        【参考文献】        1 MURRY C E, JENNINGS R B, REIMER KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in is

25、chemic myocardiumJ. Circulation,1986, 74: 1124-1136.        2 LI Y J,XIAO Z S, PENG C F. Calcitoningenerelated peptideinduced preconditioning protects against ischemiareperfusion injury in isolated rat heartsJ. Eur J Pharmacol,1996,311:163-167.  

26、0;     3SPECTOR D L, GOLDAM R D, LEINWAND L A. Cells: A laboratory mannul. volum 1:culture and biochemical annlysis of cellJ. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998, 111-119.        4YAMASHITA N, KUZUYA T, HOSHIDA S, et al. Relationship between time interval from preconditioning to sustained ischemia and its effect on limiting infarct sizeJ. Mol Cell, 1992, 24: 150.    &