实时荧光定量PCR [兼容模式]

1、实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR的原理和应用PCR(Polymerase Chain Reaction : 聚合酶链式反应聚合酶链式反应是一种扩增特定的DNA片段的分子生物学技术, 能将微量的能将微量的DNA DNA DNA大量复制大量复制。 94 PCR分四个阶段 qPCR 技术:qPCR技术是在PCR实验方法的基础上发展而来的技术,能够对PCR扩增的目标DNA进行定量分析。具有灵敏度高、特异性强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点普通PCR技术:扩增目标DNA量,对目标DNA片段做定性分析,但无法准确得知目标DNA的含量优点:实时监

2、测、不需电泳、精确定量等qPCR 在PCR 的基础上加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号累积实时监测整个PCR 反应过程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。SYBR green 一、qPCR 定义定义、原理和常用荧光染料是目前最常用的荧光染料光染料,它能够结合双链状态的DNA 分子,一旦结合就能够发出荧光,但未结合DNA 的游离SYBR green 没有任何荧光。SYBR green 荧光强度反映了当前样品中的DNA 浓度 实时荧光扩增曲线图 在指数增长期检测荧光值:无法在同一时间点保证所有样品都处在对数增长期阈值在指数增长期选择一个荧光阈值,浓度高的样品比浓度低的样品先到达阈值为了定量

3、和比较的方便,在实时荧光定量PCR 技术中引入了几个重要的概念:基线(Baseline:是指在PCR扩增反应的最初基线数个循环里,荧光信号变化不大。接近一条直线,这样的直线即是基线。荧光阈值(thresholdC T:是在荧光扩增曲线荧光阈值上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,一般荧光域值的设置是基线(背景荧光信号的标准偏差的10 倍。荧光域值是PCR的315个循环荧光信号标准差的10倍,荧光域值设定在PCR扩增的指数期。 阈值C T值C T值(cycle threshold:样品荧光值到达阈值样品荧光值到达阈值,所经历的循环数C T值越小,样品浓度越高 E:扩增效

4、率X0:起始DNA浓度 用已知浓度值的样品(标准品作标准曲线,并测得CT值。由标准品的CT 值与浓度值(X可以得到方程式中的常数值 根据公式可以通过CT值计算出未知样品的浓度。 二、Real-time PCR 方法应用绝对定量(Absolute Quantification,AQ病原体检测转基因食品检测基因表达研究相对定量(Relative Quantification,RQ基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究绝对定量与相对定量的定义 绝对定量通过标准品定量绝对定量的标准样品:已知拷贝数的质粒DNA,做系列稀释。标准样品的种类:含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同

5、扩增片段的cDNAPCR的产物绝对定量绝对定量:从荧光到拷贝数 相对定量通过内标定量内标(Endogenous Control通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定,受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量内标(内参照-校正模板在数量上的差异qPCR定量实验是需要设定内参照的,排除用于检测的样品添加量的差异。在实际操作中,很多环节导致用于定量实验的样品添加量是不一样的。细胞都会表达一种叫做管家基因的基因,它的特点是,无论什么组织,什么细胞,在何种状态下,管家基因的表达量是恒定的。选用管家基因作为内参照,其含量正比于细胞数作为内参

6、照,统计数据时根据管家基因含量较正数据,就可以排除添加量的影响。常用的内参照:GAPDH, Actin, 18S-rRNA相对定量:参照因子Calibrator 相对定量分析方法1 2-Ct前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100%且偏差在5%以内1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值:CT(test= CT (target,test -CT (ref,testCT(calibrator= CT (target, calibrator -CT (ref, calibrator 2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值:CT= CT(test -CT(calibrator3、计算表达水

7、平比率:2 CT=表达量的比值实例对照组实验组 相对定量分析方法2:双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度待测样品内参基因浓度F=对照样品目的基因浓度对照样品内参基因浓度一次qPCR实验的分组设置对照组实验组阳性对照已知必定能得到扩增曲线的样品用于判断实验过程是否存在问题,排除假阴性阴性对照(空白对照不添加DNA模板,其余成分齐全用于排除污染等因素导致的假阳性三、荧光标记的种类非特异性荧光标记:SYBR Green特异性荧光标记:TaqMan,Molecular Beacon(分子信标法,Amplisensor(复合探针法1、SYBR Green 法 SYBR Green法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便-不必设计复杂探针非常灵敏便宜熔解曲线反应结束后设定一个升温过程,然后慢慢把温度降下来,因为不同DNA 片段的解链温度不同,这时若PCR 产物纯,则只会出现一个荧光峰,若有杂质,则会出现其他峰值,这是一个特异性检测方法。验证扩增产物特异性,防止引物的非特异性干扰定量检测结果。 2、TaqMan探针法 TaqMan探针的工作原理 TaqMan法优缺