女贞子等中药对小鼠毛囊生长周期中生长因子mRNA表达的影响

1、    女贞子等中药对小鼠毛囊生长周期中生长因子mRNA表达的影响        【摘要】目的探讨女贞子等中药促毛囊生长的机制。方法我们应用RTPCR技术和凝胶密度扫描分析技术，对正常生长周期中毛囊肝细胞生长因子(HGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA表达水平，以及女贞子等中药对体外培养小鼠触须毛囊HGF和VEGFmRNA表达水平的影响进行了深入的研究。结果我们的研究发现正常毛囊生长周期中，生长期毛囊有明显的HGF和VEGFmRNA表达，而退行/休止期毛囊则很难检

2、测出上述因子mRNA的表达。在毛囊生长发育的过程中，HGF和VEGFmRNA表达也逐渐减弱。与女贞子混合培养的毛囊，在培养的第6天仍有相当量的HGF和VEGFmRNA表达，而相应的对照组则未能测到这些因子的表达。而与齐敦果酸培养的毛囊在培养的第6天仅有HGFmRNA表达，而无VEGFmRNA的表达。结论女贞子及齐敦果酸可促进体外培养的毛囊对HGF和(或)VEGFmRNA的表达。从而从分子生物学水平揭示了上述药物促进毛囊生长的可能机制。【关键词】毛囊肝细胞生长因子内皮生长因子女贞子Expression of Growth Factor mRNA in Hair Follicles Culture

3、d with Some Chinese HerbsFAN WeixinZHUWenyuan.（Department of Dermatology. The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029）【 Abstract】 Objective To investigate the molecular mechanism of hair growth stimulated by some Chinese herbs. Methods Expression of hepatocyte growth

4、factor (HGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA was detected by RTPCR in normal hair cycles and in hair follicles cultured with some Chinese herbs. Results Expression of HGF and VEGF mRNA varied in normal mouse vibrissa follicles during hair growth cycles. HGF and VEGF mRNA were dete

5、ctable in anagen follicles, but not in catagen/telogen follicles. The expression of HGF and VEGF mRNA decreased gradually in the follicles from very early anagen to late anagen. At the sixth day the expression of HGF and VEGF mRNA was still detectable for the group in which the follicles were cultur

6、ed with Ligustrum lucidum(A), but not for control group. At the sixth day HGF mRNA expressed only when the follicles cultured with olianolic acid, an active ingredient of Ligustrum lucidum. Conclusion The results demonstrate that there is varying expression of HGF and VEGF mRNA in the hair growth cy

7、cles of mouse vibrissa follicles.Ligustrum lucidum (A) is shown to up? regulate the expression of HGF and VEGF in mouse vibrissa follicles culture model. 【 Key words】 Hair follicles Hepatocyte growth factor Endothelial growth factor Fructus ligustri lucidi肝细胞生长因子(HGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)是新近发现于毛乳头的两个生长因

8、 子。他们是由生长期毛囊的毛乳头分泌，并对毛发生长有明显的促进作用1,2。为了解 它们在整个毛囊生长周期中的动力学改变，我们通过RTPCR和半定量RTPCR技术，对 生长周期不同阶段毛囊HGF和VEGF的 mRNA表达水平进行动态观察，发现在生长周期的不同阶段，毛囊HGF和VEGF的mRNA表达 水平有明显变化。我们还研究了某些促毛发生长药物与毛囊HGF和VEGFmRNA表达的关系。现将研究结果报道如下。 材料和方法 一、实验动物 小鼠触须毛囊取自出生3565d近交系C57BL/6J小鼠，雄鼠24只，雌鼠29只。具体培养方法 同文献3。 二、毛囊生长周期中VEGF和HGFmRNA表达的研究 1

9、.实验分组:实验分6组，每组20个毛囊,分组依据同文献4。他们分别是生长期毛 囊；生长期毛囊；生长期毛囊；生长期毛囊；退行期/休止期毛囊；阴性 对照组（毛囊间结缔组织）。 2.总RNA提取：分离的毛囊立即放入1mLTrizol（购于生命技术公司）中，总RNA提取严格 按照试剂盒说明步骤进行5。 3.RTPCR：采用一步法RTPCR放大系统（AccessRTPCRSystem）试剂盒（购于Promega公 司）。特异性针对小鼠VEGFmRNA的一对引物的序列分别为5' CAGGCTGCTGTAACGATGAA3'和5'AATGCTTTCTCCGCTCTGAA3'。

10、扩增产物为207bp6。特异性针对小鼠HGFmRNA的一对引物序列为5'CCATGAATTTGACCTCTATG3'和5' ACTGAGGAATGTCACAGACT3'，扩增产物为278bp7。RTPCR在PERKINELMER2400上完成。详细 步骤见Schroppel等6和Yang等7的研究。RTPCR产物在质量分数为2琼脂糖凝胶上电泳 ，溴乙啶染色。凝胶扫描，象打印。 4.内参照:研究中设立阴性对照，为保证实验的准确性，反应体系中还加入针对小鼠 肌动蛋白mRNA的特异性引物作为内参照来证实标本中mRNA已被完整的提出，同时还可 作为半定量RTPCR的内参

11、照物。 5.RTPCR反应产物的定量：RTPCR扩增后的产物经质量分数为2琼脂糖凝胶电泳后， 溴乙啶染色，紫外线下对凝胶进行密度扫描，从而得出各阳性条带的绝对密度。该工作 在美国基因公司生产的密度扫描仪上进行。 三、中药及其单体对体外培养小鼠触须毛囊中VEGF和HGFmRNA表达水平的研究 女贞子、黄芪和白芷的培养质量浓度为2.5mg/mL，齐敦果酸培养质量浓度为130g/mL。 阴性对照组为单纯毛囊培养。每组20个毛囊，分别培养2d、4d和（或）6d。毛囊分离、 总mRNA提取、RTPCR、电泳、溴乙啶染色、凝胶扫描定量等同前。 结果     1毛囊各

12、生长周期血管内皮细胞生长因子mRNA表达RTPCR电泳结果 四、黄芪、白芷和齐敦果酸对体外培养小鼠触须毛囊VEGFmRNA表达影响 培养的第2天，各组都有207bp的VEGFmRNA表达，与阴性对照之间无明显差异。培养第 6天，各组与对照组一样，都未检测到VEGFmRNA表达。各标本中都有500bp肌动蛋白 mRNA表达。 五、中药及其单体对体外培养小鼠触须毛囊HGFmRNA表达的影响 各组毛囊标本均可见肌动蛋白特异性mRNA表达。培养第2天，与女贞子、黄芪、白 芷、齐敦果酸培养的毛囊和单纯培养的毛囊（阴性对照组）均有明显的278bpHGF mRNA表达（链A,C,E,G,I）。但培养到第6天

13、，女贞子组、齐敦果酸组仍有一定量的HGF mRNA表达（链B,H），而黄芪、白芷和对照组则未能检测到HGFmRNA的表达（链D,F,J） 。RTPCR产物电泳结果的凝胶密度扫描定量分析显示，培养的第6天，女贞子组和齐敦 果酸组HGF/肌动蛋白的密度比值明显高于相应的阴性对照组（P<0.01）。 讨论 我们通过RTPCR技术，对小鼠触须毛囊生长周期HGF和VEGF的动态变化进行了研究，结 果发现它们在毛囊的生长期各阶段都有明显的表达，而在退行期/休止期几乎没有表达。 即使在毛囊的生长期的不同阶段，其表达的程度也不一样。生长期的早期毛囊（生长期 和生长期）HGF和VEGFmRNA表达较多。随

14、着生长期毛囊不断生长发育成熟，到 生长期中期和晚期HGF和VEGFmRNA表达逐渐减少。这就进一步证实了HGF和VEGF对毛囊 生长周期和毛发生长正相调节的重要性。 动物实验发现女贞子使小鼠耐缺氧能力增加，并有抗衰老作用。以往的研究中我们发现 女贞子在小鼠触须毛囊体外培养中能明显促毛发生长。进一步用其主要活性成分齐敦果 酸进行毛囊体外培养研究，也发现该单体对毛囊生长有明显促进作用。但女贞子以及齐 敦果酸促进毛发生长的机制目前还不清楚。本研究中发现女贞子能使培养的毛囊VEGF和 HGFmRNA表达上调，表达时相明显延长。由此可以推测，女贞子促毛发生长的机制之一 是通过促进毛乳头VEGF和HGF的

15、分泌而促进毛囊生长。有趣的是女贞子的主要有效成分 齐敦果酸只上调体外培养的毛囊HGFmRNA的表达，而未表现出对VEGFmRNA表达。这就在分子水平给我们两个重要提示： 齐敦果酸是女贞子中促进毛发生长重要的有效成分，它通过促进毛乳头HGFmRNA表达而 促进毛发生长。女贞子中还有其它有效成分通过促进毛乳头分泌VEGF和(或)HGF而促进 毛发生长。 黄芪的主要成分是黄芪皂甙类、多糖类和黄酮类。我们以往的研究发现黄芪对体外培养 的小鼠触须毛囊有明显的促生长作用，但在用黄芪的主要活性成分黄芪总甙做小鼠触须 毛囊体外培养中未见明显促毛发生长作用。黄芪促毛发生长的机理目前还不清楚，研究 发现黄芪能明显

16、延缓人胚肺二倍体细胞自然衰老的进程，延长细胞寿命达1/3左右。在人 和鼠的胚肾细胞培养中加入0.5的黄芪后，活细胞数明显增多，细胞生长旺盛，细胞在 体外的生长寿命延长1倍左右。本研究中发现黄芪不能上调体外培养毛囊对HGF和VEGF mRNA的表达。但有研究发现黄芪煎剂对血浆和细胞内环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟 苷（cGMP）的浓度有明显影响,从而使cAMP/cGMP的比值发生变化。那么黄芪促毛发生长 是否通过改变毛囊细胞的cAMP和cGMP的含量的机制有待进一步的研究。江苏省中医药管理局和省科委资助作者单位：范卫新（210029南京，南京医科大学第一附属医院皮肤科）朱文元(210029南京

17、，南京医科大学第一附属医院皮肤科指导者)参考文献348.1999,28:8083.30.4Stenn KS, Prouty SM, Seiberg M. Molecules of the cycling hair follicle a tabulated review. J Dermatol Sci, 1994, 7 Suppl: S109 S124. 5Chomczynski P. A reagent for the single step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques, 1993, 15: 532 537. 6Schroppel B, Huber S, Horster M, et al. Analysis of mouse glomerular podocyte mRNA b