MBL基因突变检测新方法及RRTI患者的突变研究

1、MBL基因突变检测新方法及RRTI患者的突变研究                          作者：薛丽, 赵新, 杨芳, 赵锦荣, 张文红, 白玉杰【摘要】  目的：建立一种新的MBL基因突变检测方法，并分析反复呼吸道感染儿童中突变频率及发病相关性。方法： PCR扩增MBL基因第一外显子区段，核酸外切酶和碱性磷酸酶降解, 清除PC

2、R产物中残余引物和dNTPs，经引物延伸反应荧光素(R110或TAMRA)标记终止碱基特异性掺入引物的3末端，测定荧光偏振值判断掺入碱基及突变类型。用所建立方法检测46例反复呼吸道感染(RRTI)患儿和50例健康对照的MBL突变。结果：所建立方法检测MBL突变经测序验证完全正确。在临床RRTI患儿及对照组中发现54位密码子G>A突变，健康儿童中野生纯合型(G/G)39例(78.00%)、杂合型(G/A)8例(16.00%)、纯合突变(A/A)3例(6.00%);RRTI患儿中野生纯合型(G/G)18例(39.13%)、杂合型(G/A)22例(47.83%)、纯合突变(A/A)6例(13.

3、04%);RRTI患儿组A等位基因频率显著高于对照组。患儿和对照组均未检测到52和57位密码子突变。结论：MBL 54G>A突变与RRTI发病风险相关，所建立的MBL基因多态性快速检测方法可用于小儿反复呼吸道感染辅助诊断和高风险人群的筛查。 【关键词】  甘露聚糖结合凝集素;基因突变;反复呼吸道感染;荧光偏振ABSTRACT Objective: To develop a rapid and sensitive method for detecting MBL genetic mutants and evaluate the association with recurrent

4、 respiratory tract infections(RRTI)in children. Methods: The MBL exon1 region was amplified by PCR, the nonincorporated primers and excesses dNTPs were removed by enzymatic digestion. The dyeterminator (R110acyC or TAMRAacyT) was incorporated on the 3end of the primer via template directed dyetermin

5、ator incorporation reaction (TDI) and the mutations were determined by fluorescence polarization (FP) assay. The MBL mutants were analyzed among 50 healthy and 46 RRTI children using this new method. Results: The accuracy and sensitivity were evaluated and verified by standard sequencing method. The

6、 54 G>A mutant was found among both healthy and RRTI children. The genotypes among healthy group were: 39 homozygote wildtype G/G (78.00%), 8 heterozygote G/A (16.00%) and 3 homozygote mutant A/A (6.00%). The genotypes among the RRTI children were: 18 homozygote wildtype G/G (39.13%), 22 heterozy

7、gote G/A (47.83%) and 6 homozygote mutant T/T (13.14%). The frequency of MBL mutation was significant higher in RRTI children than in healthy controls. The 52C>T and 57G>A mutants were not found in both groups. Conclusions: The MBL mutation associates with the risk of RRTI among children. This

8、 new MBL genotype can be used to help the diagnosis and screening the high risk children for RRTI.KEY WORDS Mannanbinding lectin;Genetic mutant; Recurrent respiratory tract infections; Fluorescence polarization甘露聚糖结合凝集素(mannanbinding lectin, MBL)是血浆中的胶原凝集素，其多糖识别结构域与细菌、真菌及寄生虫等表面的甘露糖或N乙酰氨基葡萄糖结合，经MBL结合

9、的丝氨酸蛋白酶1和2(MBL associated serine proteases1/2, MASP1/2)激活补体，或介导免疫调理及炎症反应而激活机体获得性免疫反应1。研究发现血浆MBL浓度降低或功能异常导致免疫机能缺陷，增加多种感染性疾病及自身免疫疾病的发病风险2，3。已发现MBL基因突变可影响蛋白表达水平及稳定性，降低血浆MBL浓度。检测MBL基因突变可预测MBL的基础水平和机体的免疫状态，不仅能辅助临床诊断，而且对预测疾病风险及预防有重要的指导价值。本研究基于模板指导的荧光标记终止子掺入反应-荧光偏振检测(template directed dyeterminator incorpo

10、ration with fluorescence polarization, TDIFP)原理，建立快速、简便的检测方法，并对46例临床反复呼吸道感染(recurrent respiratory tract infections, RRTI)患儿和50例健康儿童进行检测，比较MBL基因突变频率的差异，发现MBL突变与RRTI患儿发病存在关联性。1 材料与方法1.1 基因组DNA提取依据RRTI诊断标准4 收集RRTI患儿46例，其中男性26例，女性20例，平均年龄4.6岁。健康对照组50例，男性25例，女性25例，平均年龄4.5岁。无菌采集外周静脉全血，置EDTA钠抗凝管中，用全血基因组DNA

11、提取试剂盒(TaKaRa大连公司)，参照使用说明书提取基因组DNA。1.2 PCR扩增PCR反应体系25L，含10×PCR反应缓冲液2.5L，10mmol/L dNTPs 0.25L，20mmol/L MgCl2 1.25L，DMSO 2.5L，基因组DNA 2L(50100ng)，Taq DNA聚合酶1.5U，10mol/L正反向引物各0.25L。引物序列分别为PF: 5TGTCCCTGTTTTCCATCACTCC3;PR: 5TGCAGAGACAGAACAGCCCAACA3。PCR反应条件为：95预变性5min，94 30s，60 30s，72 30s，共45个循环，随后72延伸

12、10min。PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪观察。1.3 TDIFP检测PCR产物预处理：采用AcycloPrimerTMFP SNP Detection Kit (PerkinElmer Life Science Co.,美国)所提供试剂并参照其说明书操作。PCR产物分为3组5L，分别加入2L Cleanup混合液(包含虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I)，37温育1.5h，清除PCR产物中残留引物和dNTPs，之后80加热20min灭活消化酶。TDI反应：各组消化处理后PCR产物7L，各加入13L AcycloPrimerFP混合液：含10×TDI反应缓冲液2L、Ac

13、yclopolTM 聚合酶0.05L、荧光标记终止碱基R110acyCTP和TAMRAacyTTP 1L，各加入1L对应的突变检测引物(序列分别为：P52C>T：5CG GCTT CCCAGGCAAAGATGGG3; P54G>A：5GGTTCCCCCTTTTCTCCCTTGGTG3; P57G>A：5CAACACTGACCTGGTTCCCCCTTTCT3)，总反应体系为20L。掺入反应条件：95预变性3min，94 15s, 62 30s，共30个循环。荧光偏振检测：采用VICTOR2 Multilabel Counter (PerkinElmer Life Science

14、 Co，美国)测定反应产物的荧光偏振值，判定掺入荧光标记碱基的类型并判读对应的基因型。分别选取TDIFP检测为突变或野生纯合型的PCR产物，常规分子生物学操作克隆至T载体pGMTeasy中，转化大肠杆菌、提取质粒、PstI和EcoRI双酶切鉴定正确后送上海生物工程公司测序验证TDIFP检测结果。验证正确的质粒作为检测系统的阳性参比标准品。1.4 统计学处理数据采用SPSS 11.5统计软件包进行分析，组间比较采用2检验，检验水准=0.05。2 结果2.1 PCR扩增结果PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳分析显示为214bp大小的特异性条带(图1)，与设计扩增产物相符。M：DNA分子量标志D2

15、000; 14: PCR产物;5:空白对照(dH2O取代模版DNA)图1 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物2.2 TDIFP检测结果经TDI反应荧光标记终止碱基R110acyCTP海南医学院学报 Vol.16 No.10 Oct.2010或TAMRAacyTTP特异性掺入突变检测引物的3末端，VICTOR2 Multilabel Counter测定其荧光强度并自动荧光偏振值(mp)，mp升高与荧光标记碱基的掺入相对应，数值聚集于4个区域(图2)。检测52C>T采用正向引物，C/C纯合子聚集于右下方(R110的mp值高表示掺入R110acyCTP)，T/T纯合子聚集于左上方(TAMRA的mp值

16、高表示掺入TAMRAacyTTP)，C/T杂合子聚集于右上方(R110和TAMRA的mp值均高，表示分别掺入R110acyCTP和TAMRAacyTTP)，左下方为阴性对照(无荧光标记碱基掺入)。检测54G>A和57G>A采用反向SNP引物，G/G纯合子聚集于右下方，A/A纯合子聚集于左上方，G/A杂合子聚集于右上方。依据所测定各样本的mp值，仪器内置的SNP macro Victor384 V4.0软件可自动判定其突变和基因型。2.3 临床标本检测采用所建立的方法分别对46例RRTI患儿和50例健康对照儿童检测MBL基因突变，两组中均检测到密码子54突变，抽取部分标本采用测序法验

17、证结果完全一致。A: 52C>T;B: 54G>A; C: 57G>A图2 TDIFP检测MBL基因突变RRTI和对照组密码子54突变分布频率见表1。等位基因的分布符合HardyWeibery平衡，RRTI组54密码子突变(A)等位基因频率(37%)显著高于对照组(14%)(P<0.05)。两组中均未检测到密码子52和57突变，结果与先前报道及亚洲人群的分布频率基本吻合5,6。表1 MBL基因54密码子基因突变频率 n(%)3 讨论由于获得性免疫尚未成熟，小儿更多依赖先天免疫系统。MBL在小儿出生前开始表达，出生后不久即接近成人水平，在先天性免疫中发挥重要作用。血浆MB

18、L水平及功能与感染、自身免疫等疾病的发生及严重程度相关7,8，了解MBL基础表达能力及功能对判断免疫状态及病因提供线索，有助于临床诊断和方案的制定。曾报道采用红细胞溶解分析(Haemolytic assays)9和补体激活实验10测定MBL活性，或用ELISA测定血浆MBL蛋白浓度11。这些技术首先存在方法上的局限性，红细胞溶解测定操作繁琐，需要纯化抗体及红细胞等实验材料;ELISA检测中抗MBL抗体优先选择性结合高寡聚体MBL，因而容易低估低寡聚体的浓度。更重要的是血浆MBL水平受多种因素影响，例如在感染或免疫疾病状态下，血浆MBL水平可反应性升高，此时测定MBL水平不能真实反映个体的基础水

19、平和免疫能力。从基因组水平分析其遗传特性，可在一定程度上反映其基础表达水平及稳定性，更好判断其基础免疫状态，尤其对于疾病预测和预防方面具有更大的价值。1         大约12%25%的个体存在MBL基因突变12,13，某些突变可导致血清总MBL水平降低14,15,免疫功能减弱，增加感染发病风险和严重程度16。例如外显子1第52密码子C>T(Arg52Cys)、54密码子G>A(Gly54Asp)、57密码子G>A(Gln57Glu)等突变，引起胶原区域氨基酸置换，干扰蛋白多聚体形成，降低蛋白稳

20、定性并加速降解。Hibberd等17对226例英国儿童的研究发现MBL基因突变与脑膜炎发病相关。Nagy等18报道携带MBL基因突变儿童衣原体IgG阳性率、反复感染和哮喘发病率均显著高于无基因突变的儿童。在汉族人群中发现MBL基因突变导致血浆蛋白水平降低，RRTI发病风险增高两倍5。本研究建立一种新的MBL突变检测方法，所依据基本原理是：溶液中荧光分子旋转速度与分子大小呈反比，大的荧光分子旋转速度减慢，其荧光偏振值则升高。设计3末端紧邻突变位点的检测引物，TDI反应中加入与野生和突变碱基互补的荧光标记终止碱基，特异性掺入检测探针3末端，掺入了终止碱基的检测引物比游离荧光标记碱基分子增大20余倍

21、，荧光偏振值也相应增高。通过检测荧光偏振值可直观判断掺入的荧光素标记碱基的类型，从而快速确定样本的基因型。该方法无须分离未结合游离荧光标记碱基，反应溶液可直接进行检测，具有操作简单、灵敏性高、通量高并易于自动化等优势。采用本方法检测临床标本的MBL基因突变，经测序验证正确。对临床RRTI患儿的检测发现54密码子G>A突变，发现RRTI组携带MBL突变频率显著高于健康对照组，等位基因分布频率与报道相似19。也表明MBL基因突变与补体免疫功能及反复感染相关，支持MBL突变为RRTI的遗传风险因子。目前已有用正常人血浆MBL重建MBL缺陷儿童免疫调理和噬菌功能的尝试20，也有开发凝集素类似物作

22、为HIV等药物的报道21，未来MBL功能调节可能成为一种重要的治疗策略。通过MBL基因多态性的快速检测，推断MBL水平及补体免疫状态，对于发现小儿反复感染的病因，以及预测发病风险具有重要的意义。因而所建立的MBL基因突变检测方法在指导临床治疗和疾病预防方面具有应用前景。【文献】  1 Takahashi M, Ishida Y, Iwaki D, et al. Essential role of mannosebinding lectinassociated serine protease1 in activation of the complement factor DJ. J E

23、xp Med, 2010, 207(1): 2937.2OlivoMarston SE, Yang P, Mechanic LE, et al. Childhood exposure to secondhand smoke and functional mannose binding lectin polymorphisms are associated with increased lung cancer risk J. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2009, 18(12): 33753383.3 Monticielo OA, Chies JA, Mu

24、cenic T, et al. Mannosebinding lectin gene polymorphisms in Brazilian patients with systemic lupus erythematosus J. Lupus, 2010,19(3): 280287.4 WHO. Respiratory Infections in Children. Management in Small Hospitals. A Manual for DoctorsJ. Geneva:World Health Organization, 1988.5 Chen J, Xu Z, Ou X,

25、et al. Mannosebinding lectin polymorphisms and recurrent respiratory tract infection in Chinese children J. Eur J Pediatr, 2009, 168(11): 13051313.6 Takahashi K, Ip WE, Michelow IC, et al.The mannosebinding lectin: a prototypic pattern recognition moleculeJ. Curr Opin Immunol，2006, 18(1): 1623.7 Nis

26、ihara RM, Utiyama SR, Oliveira NP, et al. Mannanbinding lectin deficiency increases the risk of recurrent infections in children with Down's syndrome J. Hum Immunol, 2010, 71(1): 6366.8 Schlapbach LJ, Latzin P, Regamey N, et al. Mannosebinding lectin cord blood levels and respiratory symptoms du

27、ring infancy: a prospective birth cohort studyJ. Pediatr Allergy Immunol, 2009, 20(3): 219226.9 Kuipers S, Aerts PC, Sjholm AG, et al. A hemolytic assay for the estimation of functional mannosebinding lectin levels in human serum J. J Immunol Methods, 2002, 268: 149157.10 Suankratay C, Zhang X, Zhang Y, et al. Requirement for the a