CMV感染病儿实时荧光定量PCR检测及意义

1、CMV感染病儿实时荧光定量PCR检测及意义        作者：刘薇蒋玉红，孙佰秀，李海峰，罗兵 【摘要】目的探讨实时荧光定量PCR法检测病儿尿液中巨细胞病毒(CMV）DNA含量在诊断和动态监测CMV感染中的意义。方法应用PE5700全自动PCR扩增分析仪，检测35例临床高度怀疑有CMV感染病儿（病儿组）尿液中的CMVDNA拷                

2、                 作者：刘薇 蒋玉红，孙佰秀，李海峰，罗兵 【摘要】  目的 探讨实时荧光定量PCR法检测病儿尿液中巨细胞病毒(CMV）DNA含量在诊断和动态监测CMV感染中的意义。方法 应用PE 5700全自动PCR扩增分析仪，检测35例临床高度怀疑有CMV感染病儿（病儿组）尿液中的CMVDNA拷贝数,随机选择45例同年龄段患非感染性疾病病儿作为对照

3、组,比较两组CMV阳性标本中CMVDNA含量，并测定治疗后的病毒载量。同时与血清CMVIgM抗体检测结果进行比较。对部分病儿进行临床观察和随访。结果 病儿组CMV感染27例,阳性检出率为77.14%;对照组CMV感染12例,阳性检出率为26.67%。治疗后两组病儿尿液中CMVDNA拷贝数下降幅度均较大,与治疗前比较, 差异有显著性（t=4.159、5.438，P<0.01）。实时荧光定量PCR法CMV阳性检出率高于血清CMVIgM检测方法。9 例病儿随访2年,1例胆管闭锁病儿手术后CMV病毒载量仍在较高水平,1年后发展为肝硬化；4例CMV 肝炎经治

4、疗后, 1 例CMVDNA转阴，3例仍阳性；4例无症状性感染病儿CMVDNA转阴或降至低水平。结论 实时荧光定量PCR技术检测CMV感染具有快捷、灵敏度高、特异度高等优点，量化结果便于对治疗过程进行连续监测，为病儿治疗和随访提供有效帮助。  【关键词】  巨细胞病毒感染；荧光免疫测定；聚合酶链反应 巨细胞病毒(CMV)是已知病原微生物中最易引起小儿急、慢性感染的病毒之一，早期准确诊断CMV感染具有重要的意义1。CMV感染的临床表现多样, 以往多通过检测血清特异性IgM以及定性PCR检测病毒DNA进行诊断，但易出现假阴性和假阳

5、性结果。本文采用实时荧光定量PCR法检测可疑CMV感染病儿尿标本中CMVDNA含量, 以评价其在CMV感染病儿诊断、治疗及动态监测中的价值。 1  资料与方法 1.1  一般资料      2005年5月2006年5月，选择青岛市儿童医院收治临床高度怀疑有CMV感染病儿（病儿组）35例，男20例，女15例；年龄2 d1岁。根据CMV感染诊断方案2，当病儿出现与CMV感染相关的症状、体征时,诊断为症状性感染;当病儿无相关症状，无或有受损器官的体征和(或)实验室检查异常,诊断为无症状性感染。并选取同

6、期45例同年龄段患非感染性疾病住院病儿作为对照组, 其中男23例，女22例。 1.2  检测方法 1.2.1  尿CMVDNA测定  采用实时荧光定量PCR方法。清洁小儿外阴, 留取新鲜尿液2 mL送检。试剂由深圳匹基生物有限公司提供, 仪器为美国PE公司PE 5700基因扩增仪，扩增结束后拷贝数小于106/L为阴性，拷贝数大于106/L为阳性，并由仪器根据标准曲线自动计算出定量结果。 1.2.2  血清CMVIgM抗体检测  采集小儿非抗凝静脉

7、血2 mL，分离血清置4 保存，采用美国HOPE公司生产ELISA试剂盒检测血清CMVIgM抗体。 1.3  治疗方法      症状性感染组病儿一经确诊有CMV感染，立即给予更昔洛韦10 mg（kg·d）加入50 g/L葡萄糖注射液100200 mL中静脉滴注，连用10 d为1个疗程，同时辅以保肝药物如维生素C、肝复肽等治疗。根据病情和肝功能、CMV病毒载量的复查结果决定治疗疗程。无症状性感染组病儿用更昔洛韦抗病毒治疗1个疗程。 1.4  随访

8、      症状性感染组和无症状性感染组病儿分别于治疗后半年、1年和2年监测肝功能和CMV病毒载量，并应用无创性超声观察小儿的肝脏形态学、血流动力学相关指标改变及肝脏是否有纤维化。 1.5  统计学方法      用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，CMVDNA拷贝数以指数表示（log10）x。计量资料组间比较采用t检验，计数资料比较用2检验。 2  结果  2.1  实时荧光定量PCR法检测    

9、  病儿组CMV阳性者（症状性感染）27例,占77.14%；对照组CMV阳性者（无症状性感染）12例,占26.67%。与治疗前比较，两组治疗后CMVDNA拷贝数指数下降幅度均较大,差异有显著性（t=4.159、5.438，P<0.01）。治疗前、治疗后两组间CMVDNA拷贝数指数比较，差异均有显著性（t=2.454、2.432，P<0.05）。见表1。 2.2  两种方法的检测结果比较      实时荧光定量PCR法CMV阳性检出率为48.75%(39/80), 血清CMVIgM检测方法CMV阳性检出率

10、为13.75%(11/80)，前者阳性检出率高于后者。 2.3  随访结果      9例病儿随访2年,1例胆管闭锁病儿手术后CMV病毒载量仍在较高水平,1年后发展为肝硬化；4例CMV肝炎病儿治疗后, 1例CMVDNA转阴，3例CMVDNA仍阳性，其中1例预后不良，3例预后良好；4例无症状性感染病儿CMVDNA转阴或降至低拷贝水平。 表1  症状性感染组与无症状性感染组治疗前后CMVDNA拷贝数指数比较（略） 与治疗前比较，t=4.159、5.438，P<0.01；与无症状性感染组比较，#t=2.4

11、54、2.432，P<0.053  讨论      CMV属疱疹病毒类,具有潜伏活动的生物学特征。CMV感染的流行病学研究表明,约有3%的新生儿在出生时就已感染CMV,表明该病毒可经胎盘感染胎儿3，造成胎儿严重疾病的感染通常发生在妊娠的最初12周内4。CMV感染在我国流行广泛,胎儿及免疫力低下的小病儿易受侵害,临床表现与年龄有关,年龄大者感染CMV后临床症状轻,可表现为无症状性感染；胎儿期和围生期发生的CMV感染临床症状较重, 表现复杂，可造成先天性脑白质发育不良,某些病例预后差,有致残、致死的可能5。本文中5例临床表

12、现严重的病儿均在出生后2月内发病,3例为早产儿, 1例胆管闭锁病儿最终发展为肝硬化。因此，及早诊断CMV感染并系统性治疗能减少并发症的发生，病儿预后良好。      本文对CMV感染病儿随访2年，有9例资料完整，其中1例胆管闭锁病儿于出生后2周发病，总胆红素和直接胆红素明显升高，10周时手术治疗后肝功能明显好转，CMV载量一直维持较高拷贝数，治疗后1年随访时已发展为肝硬化，预后不良。4例无症状的CMV 感染病儿,在治疗后2例CMVDNA转阴，2例降至低水平的阳性，随访2年预后较好，肝功能正常，超声检查肝脏正常。4例CMV肝炎病儿中1例

13、治疗后CMVDNA转阴，3例治疗后病毒载量下降，其中1例于出生后2周发病病儿治疗后病毒载量下降不明显，随访2年中一直在较高水平，肝功能在治疗后半年时又出现异常，谷丙转氨酶升高1倍，抗病毒和保肝治疗后肝功能正常，超声检测提示肝脏轻度纤维化。肝纤维化是肝硬化的早期阶段，是可逆性的，一旦发展至肝硬化则难以恢复6。所以，对CMV感染病儿要在治疗后几年中监测CMV病毒载量和肝功能水平，发现异常后及时治疗，防止肝脏纤维化的发生。先天性胆管闭锁过去认为是一种先天畸形，由发育障碍引起，近年来提出炎症学说。本文有1例肝外胆管闭锁病儿经血清学及尿标本CMVDNA检测均证明有CMV感染，临床上表现为黄疸颜色深,大便

14、白色,肝脏进行性增大、质硬，手术后1年出现肝硬化,预后不良，从病毒学角度证明CMV肝炎可能发展为胆管闭锁。该病儿可能在出生前由母亲胎盘感染CMV，引起胆管炎症，进而出现胆管闭锁。     以往国内对CMV感染的诊断主要依赖血清特异性IgM的检测,但由于IgM受人体生理及病理状况影响,易出现假阴性，而且本文研究对象均为1岁以内的病儿，其细胞和体液免疫系统发育不成熟，感染病毒后不能有效产生免疫应答7             

15、60;   以往国内对CMV感染的诊断主要依赖血清特异性IgM的检测, 但由于IgM受人体生理及病理状况影响, 易出现假阴性，而且本文研究对象均为1岁以内的病儿，其细胞和体液免疫系统发育不成熟，感染病毒后不能有效产生免疫应答7，可出现假阴性,所以用血清CMVIgM检测方法确诊CMV感染具有局限性。本文实时荧光定量PCR法CMV感染阳性检出率为48.75%(39/80),而血清CMVIgM检测方法CMV感染的阳性检出率为13.75%(11/80)，说明实时荧光定量PCR法可以提高小儿CMV感染的检出率。实时荧光定量PCR法采用荧光探针定量基因检测技术，是在

16、常规PCR技术基础上发展起来的一种新型定量检测法8。与定性PCR方法相比, 实时荧光定量PCR法采用完全闭管检测, 无PCR后处理, 避免了交叉污染,通过探针杂交进一步提高了特异性9；检测信号实时检测产物量,定量结果准确，而且重复性好，可用于体内CMV的动态监测。实时荧光定量PCR法测定尿CMVDNA含量可用于临床早期快速诊断小儿CMV感染,对于指导临床治疗、评价抗病毒治疗的效果具有重要临床意义。      由于本研究随访到的资料完整的病例数较少,不足以说明病儿CMV感染的预后情况，有待继续积累资料，进一步探讨实时荧光定量P

17、CR法在监测病儿CMV感染转归中的价值。 【参考文献】   1尚世强,陶然. 儿童巨细胞病毒感染的诊断J. 实用儿科临床杂志, 2006,21(22):15981600. 2方峰,董永绥. 巨细胞病毒和巨细胞病毒感染的诊断J. 中华儿科杂志, 1999,37:397399. 3黄素芳,于立君. 荧光PCR基因检测技术诊断小儿活动性巨细胞病毒感染的研究J. 哈尔滨医科大学学报, 2005,39(5):454455. 4LANDINI M P, LAZROTT

18、O T. Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection: light and shadeJ. Herpes, 1999,6(2):4549. 5GRIFFITHS P D, WALTE R S. CytomegalovirusJ. Curr Opin Infect Dis, 2005,18(3):241245 6熊苑,王绍映. 肝病儿童血清型前胶原临床研究J. 重庆医