mtDNA异质性及其法医学应用

1、mtDNA异质性及其法医学应用        【关键词】mtdna；异质性【中图分类号】d9192【文献标识码】b【文章编号】10079297(2006)02014004线粒体dna(mitochondrial dna，mtdna)是惟一的细胞核外dna。人类mtdna为一裸露的环状双链结构，长16569 bp，由富含嘌呤的重链(h链)和富含嘧啶的轻链(l链)组成。mtdna编码区的序列相对保守，其非编码区长1 122 bp，又称为控制区。控制区的碱基变异相对集中分布在1599616401nt和29408nt两个区

2、段，分别称为hv i和hvli。后来，lutz等【l】发现在438574nt间也存在较多的碱基变异，称为hv。mtdna呈母系遗传特征，加之其拷贝数多、突变率高、抗腐败能力强，具有极高的法医学应用价值。个体发育源于一个受精卵，理论上同一个体所有的mtdna序列应是一致的。但实际却发现有少数同一个体的mtdna碱基序列并不完全相同。这种同一个体mtdna出现两种或两种以上的碱基序列的现象称为异质性(heteroplasmy)。121其在人体的存在表现为同一个体不同组织、同一组织不同细胞或同一细胞不同线粒体之间存在不同的mtdna序列。一、mtdna异质性形成的可能机理mtdna异质性发生机制至今

3、还不是很清楚hauswih和laipis(1982)在研究牛线粒体dna多态性时发现异质性线粒体dna在卵母细胞和胚胎早期发育阶段发生快速分离的现象，从而提出线粒体dna遗传的瓶颈理论。31后来人们多用该理论来解释mtdna异质性的形成原理。mtdna异质性的本质是突变即突变型和野生型mtdna以不同比例共存，其发生与mtdna拷贝数多、不对称复制及缺乏校正修复机制等密切相关。瓶颈理论认为：卵母细胞在分化成卵细胞及形成受精卵的过程中，卵母细胞和受精卵中数千个mtdna子集合群体(不同序列mtdna混合)，似通过瓶颈一样的阻塞作用而使各个mtdna子集合群体数量明显减少，只有少数mtdna进行选

4、择性复制，故一种突变基因型可以占优势并固定出现在下一代中。ashley等41发现该“瓶颈理论”结果与人类mtdna相似，即在单个个体中异质性的大小可以改变，子代可以有不同的基因型，仅仅两三代异质性就可以转为同质性。共存的突变型和野生型mtdna通过减数分裂或有丝分裂随机分布到子代细胞中，由此细胞中突变型和野生型mtdna比例随之发生随机增减，也称遗传渐变，最终，再分裂的子代细胞有向全部为突变型或野生型mtdna。即同质体的方向发展的趋势，该过程称为“复制分离”。随着复制分离和遗传渐变的发生，一些mtdna中选择作用不明显的突变建立起同质体并以一定的频率保留于人群中形成mtdna某些区段的多态性

5、。然而，一些重度突变因复制分离造成的同质体个体极易因自然选择而淘汰。因而，多数重度突变无法建立起同质体，表现为异质体，异质体在人群中往往只能建立较低频度的多态性。遗传瓶颈出现在卵细胞形成过程中的推测后来得到了证实。bendall等【5i研究了180对双胞胎，其中发现4例有异质性。采用遗传渐变理论模式推算，估计减数分裂的代间瓶颈大约有2至，100个分子对于特定的母子间传递的mtdna估计有32o个分子作者计算人mtdnahvi的突变和固定的率在12x1o 27×10-5每代、每位点之间，相当于1个转位突变2500年至1转位突变55000年的范围。调查结果与其他文献报告基本相符，说明遗传

6、瓶颈相对比较狭窄，形成了一种制约因素。调查结果也证实，不同的母系间的瓶颈大小确有差异。一个成年人体内mtdna估计有一兆，mtdna复制聚合酶缺乏忠实性，受精后的细胞发育过程中出现变异，形成组织间mtdna型别差异的可能性的确存在。有研究发现原胚层组织异质性是一致的，胎儿各组织型别一致，但到了成人，不同组织的异质性分布【作者简介】翟仙敦(1977一)，女，山西临汾人，硕士研究生，助教，主要从事法医遗传学研究。tel：+8602783692645；email：sanmao506 163corn 。法律与医学杂        &

7、#160;志2006年第l3卷(第2期)出现差异。tully等(1998)用dgge方法检测21名成年人不同组织如血、骨、毛发、肝、肌肉，发现异质性出现的程度有差异，有的容易检出 有的不能检测。研究资料显示，在细胞分化、发育过程中，也可有mtdna控制区碱基变异。实验观察组织问异质性的发生存在与卵细胞形成过程中类似的瓶颈，ciafaloni等发现同一个体不同组织变异型与野生型mtdna出现率有差异，证实了组织问存在异质性的分离。例如某妇女，经过多次提取口腔拭子和血样，检测出异质性，同个体头发材料，5根是16355t，3根是16355c，2根是两种型的混合物。提示在细胞分化、发育过程中也可能存在

8、另一种瓶颈。二、mtdna异质性的类型及好发位置异质性按其存在形式分为点异质性和长度异质性两类，它既可发生在代问也可发生于代内。正常人mtdna异质性高发于控制区，而编码区几乎没有。61通常，异质性序列之间差异仅限于某一个碱基，称为点异质性。同时出现两个位置碱基序列不同的概率虽小，但仍有报道：而同时出现3个或者3个以上的情况至今尚未见报道。mtdna序列变异主要是复制过程中碱基错配，其中转换占90以上。少数是颠换。点异质性主要集中于hvi和hvii。hvi碱基转换类型多发生在嘧啶之间，约为80。hvii的转换碱基中，嘧啶与嘌呤约各占一半。颠换多发生于c和a之间并几乎都集中在hvi。人群中点异质

9、性的发生率因检测方法的灵敏度不同而差异很大。hvi 16 189nt碱基替换的发生率很高，其中tc转换高达l5。长度异质性主要发生于hvi 16184 16193 nt和hvii 303315 nt的cstretch区，表现为c数目的差异。在序列测定时可观察到16 189 nt和310 nt后多个信号峰交叠形成的模糊序列，即“手指样结构”。71根据anderson序列，cstretch分别于16 189 nt和310nt被t阻断，可能由于复制滑动引起的相同碱基单调连续趋势，该区被认为是突变的热点 而这一趋势产生了长度异质性。bendall等8】也认为长度异质性形成原因主要是dna 复制滑动。无

10、关个体问mtdna长度异质性差异较大，根据hvii 303 309nt碱基c数目的多少，可分为单纯同质性(c7)、轻度异质性(c8为主)、明显异质性(c8和c9为主)和tc转换后序列失控(c10一c14)4种。hvi 16 189nt约l5的tc转换中又有66形成长度异质性。91与hvi不同，hvii的t很少缺失。由此认为hvii的长度异质性机制是c在303309 nt区域内的插入和复制滑动，形成3lont p c的转换。同一母系中，与16 189· l4l ·突变相关的长度异质性，分布和变化相对稳定，但无关个体问差异很大。bini等1ol研究发现异质性长度c的个数与cst

11、retch上游的a碱基数目呈负相关，相对于c数目的不稳定性，同一个体a数目恒定，这一发现对家系分析和法医学领域中包括单根毛发在内的组织比较有较大意义。一般而言，如果cstetch区的c多于8个，就会增加长度异质性的几率。1通常骨骼肌和神经组织的异质性水平相似，毛发中相对较高外周血的异质性最低。121三、mtdna异质性检测方法(一)测序序列测定是检测mtdna多态性和异质性最常用的方法。尽管一直以来测序被认为是检测突变的金标准，但若异质性水平低于20该方法即很难检出，这也是先前普遍认为异质性发生率很低的原因。克隆后测序又比pcr产物直接测序更可靠，因其可排除因pcr过程中taq dna聚合酶滑

12、脱造成的序列改变。对hvii轻链测序发现，由于临近cstretch区产生的长度异质性使3lont的异质性比率达50，这是一种普通的人为假象，通过对重链的测序可消除该假象。131因此为避免可能存在的影响，mtdna高变区序列测定要求对重链和轻链进行双向测序，并至少重复一次。(二)序列特异性寡核苷酸(aso)探针杂交pcraso分析技术先用pcr扩增得到靶dna片段，再用aso探针与目的dna扩增片段杂交阳性结果说明靶dna含有与探针相应的等位基因。尽管pcraso分析技术有操作简单、灵敏度高、特异性好等优点，但目前所用特异性探针较少，系统的个人识别能力有限是其局限性之一。多重pcr特异性寡核苷酸

13、片段用于检测突变链，可以发现小于l的异质性，然而等位特异性扩增很容易受pcr初始熔链温度的影响，易发生错误的扩增，且无法估计异质性的数量。(三)限制性片段长度多态性(restriction 哪entlength polymorphism，rflp)分析在mtdna高变区，大约有23的碱基变异涉及限制酶识别位点，故可用rflp检测点异质性。与直接测序相比，荧光rflp分析较低程度的异质性更灵敏一些。但应注意避免因不完全消化而导致错误的结论。(四)单链构象多态性(single strand conformationpolymorphism，sscp)分析pcrsscp技术可灵敏地检测到单一碱基的突

14、变，且具有操作简单、快速、成本低、灵敏度高、无假阳性等特点，适用于大样本dna突变的筛查。但存在影响因素较多、条件不易掌握及带型难以解释等问题。· 142 ·基于毛细管电泳技术发展起来的荧光sscp(fsscp)技术，其灵敏度非常高，特异性好，但技术要求及成本均很高。(五)变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gelelectrophoresis，dgge)dgge是基于待测dna片段双螺旋的解链温度(tm)来进行突变检测的，它具有灵敏度高、分离片段可回收测序、一次可检测大量样本等优势。1999年，steighner等在评估pcrdgge技术检测mtdn

15、ahv1序列多态性的可靠性时。所有设计的49对配对序列(每对仅存在1bp差异)用该技术可全部有效加以区分。pcrdgge技术检测异质性的灵敏度高达l ，远远高于序列测定。但该技术存在实验之初需进行计算机分析或预试验以确定最佳的分离条件、需使用带gcclamp的引物增加了实验费用、gc含量较高的片段不易分析、制备精确的梯度凝胶需要熟练的操作技巧及复杂的仪器设备、仅能检测突变的存在不能确定突变的类型等不足(六)变性高效液相色谱(denaturing highperformanceliquid chromatography，dhplc)技术dhplc是一种可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸插入或缺失的一种高性价比分离技术具有自动化、快速、经济、检出率高、检出dna片段大小范围广、既可分析已知突变也能筛查未知变异等优点成为目前分析已知或未知基因突变及单核苷酸多态性的最佳技术平台。目前只有fsscp技术在敏感性和特异性方面能与dhplc相媲美。其不足是不能检测纯合突变(要检测纯合变异一定要预混等量的野生型样品以产生异源杂合双链)，只能提示突变的存在无法确定具体的错配类型及位置，尚需测序进一步确定；许多片段有多个主要解链温度需要筛查的温度点较多，增加了工作量。dhplc可直接通过异源双链的形成来检测异质性的存在。