不同样品核酸荧光定量PCR完美解决方案

1、不同样品核酸提取不同样品核酸提取、扩增扩增、荧光定量PCR 完美解决方案北京百泰克生物技术有限公司北京百泰克生物技术有限公司(北京市海淀区上地信息路北京市海淀区上地信息路151515号号Fax :010-*不同样品核酸提取不同样品核酸提取、扩增扩增、荧光定量PCR 完美解决方案-核酸提取攻略核酸提取攻略北京百泰克生物技术有限公司北京百泰克生物技术有限公司(北京市海淀区上地信息路北京市海淀区上地信息路151515号号不同样品不同样品RNA RNA RNA提取最适方法提取最适方法 RNA RNA纯度与质量考察纯度与质量考察RNA RNA提取常见问题及解决方案提取常见问题及解决方案内容概要常见样品常

2、见样品DNA DNA DNA提取提取特殊样品特殊样品DNA DNA DNA提取提取DNA DNA分离纯化中常见问题分析分离纯化中常见问题分析样品裂解液液氮研磨抽提离心洗涤酒精沉淀或介质吸附RNA 提取流程上层溶液或其他方法处理细胞裂解干燥溶解或洗脱沉淀法沉淀法:异丙醇或乙醇 介质吸附法介质吸附法:RNA 提取常用方法-沉淀方法吸附材料原理硅基质高盐低pH值结合核酸,低盐高pH值洗脱阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸,高盐低pH值洗脱磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附并携带RNA异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法在变性剂异硫氰酸胍的作用下,细胞被裂解,同时核蛋白体上的蛋白变性,核酸释放;释放出来的DNA和

3、RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别RNA 提取常用方法-裂解方式位于整个体系中的中间相和水相,从而得以分离; 有机溶剂抽提,沉淀,得到纯净RNA。胍盐/-巯基乙醇盐酸胍裂解样本,抑制RNase 的活性; -巯基乙醇变性蛋白BioTeke的RNA提取试剂具有明显的优势不断升级。在经典试剂的基础上,不断升级在经典试剂的基础上提取试剂:多款高品质的RNA提取试剂Tri pure (Trizol法的升级产品RNApure(Trizol法的升级产品组织组织/细胞样品细胞样品RNA RNA RNA提取提取 材料材料:小鼠肝脏组织方法方法:BioTeke RNApure 高纯总RNA快速提取试剂盒0.

4、1g 样品组织 结果结果:图:小鼠肝脏组织小鼠肝脏组织RNA RNARNA快速提取试剂快速提取试剂RNA高纯总RNARNApure 高纯总高纯总RNApure 图片说明:1 BioTeke RNAclean2 BioTeke TRIpure (TRIzol法3 BioTeke RNApure 离心柱型(注:本图实验材料为植物叶片同一样品基因组DNA 和RNA 分提原理原理: 根据基因组DNA 和RNA 在硅基质膜上的结合条件不同,用两根离心吸 附柱分别提取基因组DNA 和RNA 。-血液血液特殊样品提取-特殊样品RNA提取RNARNA提取 图1全血样品溶解在TRIpure LSReagent试

5、剂后的状态图2泳道1与2,在-80度保存一个月后的提 取结果。M泳道:标准的Hela细胞RNA 材料材料:松针松针、冬青冬青、香蕉香蕉、木菠萝和杨树方法方法:通用植物总多糖多酚植物样品多糖多酚植物样品RNA RNA RNA的提取的提取RNA 提取试剂盒(离心柱型离心柱型0.1g 样品组织结果结果:得率得率:约3535-40g图片说明图片说明:1、2 2 杨树杨树杨树;3、4 4 香蕉香蕉香蕉;5、6 6 松针松针松针;7、8 8 冬青冬青冬青;9 9 、10 10 木菠萝木菠萝1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Micro RNA Micro RNA提取提取1 2 3 4提取原理提取原理:

6、传统方法:先提取总RNA然后跑胶回收或沉淀Micro RNA。新方法:通过裂解液裂解和酸酚分层后过柱两次,一次去除基因组DNA和大片段RNA,图片说明:1、2DNA 和大RNA ;3、4Micro RNA(材料为小鼠肝脏组织后一次吸附Micro RNA,然后漂洗收集。新方法特点新方法特点:高效分离小RNA,同时分离总RNA 可用于miRNA、siRNA和snRNA的分析 适用各种来源的样品提取时间短,约30分钟完成实验生物大分子具有共轭双键生物大分子具有共轭双键,在260260和和280nm 280nm波长处有光吸收波长处有光吸收峰。纯度纯度:紫外分光光度计测定所提总紫外分光光度计测定所提总R

7、NA RNA RNA在在260nm 260nm和和280nm 280nm波长波长RNA RNA纯度与质量考察纯度与质量考察处的光吸收处的光吸收,以A260/A280A260/A280的比值来判断总的比值来判断总的比值来判断总RNA RNA RNA的纯度的纯度的纯度。质量:甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。RNA RNA提取常见问题及解决方案提取常见问题及解决方案RNA RNA 的降解的降解OD260 /OD280 OD260 /OD280 比值偏低比值偏低 电泳带型异常下游实验效果不佳RNA 的降解新鲜细胞或组织新鲜细胞或组织:裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不

8、足 组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏,胸腺等,很难避免RNA 的降解。 建议在液氮条件下将组织碾碎,并且匀浆时使用更多裂解液。RNA 的降解冷冻样品冷冻样品:样品取材后应立即置于液氮中速冻,然后可以移至-70冰箱保存。样品要相对小一点; 先用液氮研磨,再加裂解液匀浆; 样品与裂解液充分接触前避免融化,研磨用具必须预冷,研磨过程中及时补充液氮。RNA 的保护采集样品的保护采集样品的保护:通常用液氮保存样品保护剂RNAfixer,样品浸泡其中可以在37保存一天,25一周,4一个月,-20一年左右。环境中环境中RNase RNase RNase的清除的清除的清除:DEPC处理各种实验器

9、具 RNAsafe对溶液中RNase进行清除。 RNA酶喷雾清除剂,可对固体表面的RNase起到清除的作用,更大程度上避免RNase的污染。蛋白质污染蛋白质污染:不要吸入中间层及有机相,加入氯仿后首先混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量,确保裂解完全、彻底OD260 /OD280 比值偏低 解决办法:重新抽提一次,再沉淀,溶解。苯酚残留苯酚残留:不要吸入中间层及有机相,加入氯仿后首先混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次,再沉淀,溶解。OD260 /OD280 比值偏低抽提试剂残留抽提试剂残留:确保洗涤时要彻底悬浮RNA,并且彻底去掉75% 乙醇。

10、 解决办法:再沉淀一次后,溶解。设备限制设备限制:测定OD260 及OD280 数值时,要使OD260 读数在0.10 -0.50 之间。此范围线性最好。用水稀释样品用水稀释样品:测OD 时,对照及样品稀释液请使用10 mM Tris,pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。非变性电泳非变性电泳:上样量超过3g,电压超过6V/cm,电泳缓冲液陈旧,均可能导致28S 和18S 条带分不开。变性电泳条带变淡变性电泳条带变淡:电泳条带异常EB 与单链的结合能力要差一些,故同样的上样量,变性电泳比非变性电泳要淡一些;甲醛的质量不高。抽提试剂的残留75% 乙醇洗涤样品中杂质的残留下游实验效果不佳(

11、下游实验效果不佳(RNA RNA降解降解降解 多糖等杂质,再次沉淀DNA DNA 污染污染使用RNase-Free 的DNase I 消化抽提RNA不同样品基因组不同样品基因组DNA DNA DNA提取提取 常见样品基因组常见样品基因组DNA DNA DNA提取提取细胞细胞/组织组织/细菌细菌/血液基因血液基因DNA DNA DNA提取提取 植物材料植物材料DNA DNA DNA提取提取特殊样品基因组特殊样品基因组DNA DNA DNA提取提取大量血液样品大量血液样品DNA DNA DNA提取提取环境微生物环境微生物DNA DNA DNA提取提取 临床样本临床样本DNA DNA DNA提取提取

12、DNA DNA分离纯化中的常见问题分析分离纯化中的常见问题分析基因组基因组DNA DNA DNA提取流程提取流程 化学方法CTAB法:适用于植物材料等。是一种阳离子去污剂,溶解细胞膜,与核酸结合。在高盐下溶解释放DNA。 SDS法:适用于血液,细胞,动物组织,细菌,酵母等物理方法基因组基因组DNA DNA DNA提取流程提取流程提取流程-细胞裂解 机械剪切,超声波破碎,研磨匀浆等。易造成DNA断裂。 酶法蛋白酶KBioTeke BioTeke基因组基因组基因组DNA DNA DNA提取系列试剂盒综合利用上述方法提取系列试剂盒综合利用上述方法 提取原理:提取原理:组织组织/细胞细胞/细菌细菌/血

13、液基因组血液基因组DNA DNA DNA提取提取特点:特点:不需要使用有毒的氯仿、苯酚等试剂多次柱漂洗确保高纯度;长度可达30-50Kb 提取原理:提取原理:植物材料基因组植物材料基因组DNA DNA DNA提取提取玉米叶片基因组玉米叶片基因组DNA DNA DNA提取提取(使用新型快速植物基因组使用新型快速植物基因组DNA DNA DNA提取试剂盒提取试剂盒提取试剂盒特殊样品基因组特殊样品基因组DNA DNA DNA提取提取传统方法适用于所有材料基因组DNA的提取?比如大量血液比如大量血液?比如土壤/比如土壤/粪便中的微生物基因组粪便中的微生物基因组DNA DNA DNA的提取的提取的提取?

14、比如病毒及其他微量样品比如病毒及其他微量样品DNA DNA DNA的提取的提取的提取?NO NO!中量中量/大量血液基因组大量血液基因组DNA DNA DNA提取提取传统方法消化后,用酚消化后,用酚/氯仿抽提,时间长,损害操作人员健康BioTeke BioTeke创新创新不用蛋白酶消化不用酚不用酚/氯仿抽提结果结果:5ml 5ml全血基因组全血基因组全血基因组DNA DNA DNA提取电泳结果提取电泳结果土壤土壤/粪便微生物基因组粪便微生物基因组DNADNADNA提取提取其他品牌试剂盒存在缺点:采用玻璃珠或钢珠破碎,导致基因组断裂严重;必须购买破碎专用设备,增加使用成本;采用包括玻璃奶、离心吸

15、附柱串联的纯化方式,导致DNA大量损失,得率很低,很难真实反映土壤微生物的多样性。BioTeke的技术创新:采用酶法破碎,保证基因组的完整性;用异丙醇沉淀DNA,DNA无损失。厂家破碎方式纯化方式提取时间是否需要专门设备BioTeke酶法破碎基因组完整离心柱吸附杂质纯度高1小时内不需要Q公司钢珠破碎基因组断裂玻璃奶同离心柱结合得率低2小时需要M公司玻璃珠破碎基因组断裂离心柱纯化得率较低2小时需要提取DNA提取DNA临床样品基因组DNA临床样品基因组病毒基因组DNA提取酵母基因组DNA提取口腔拭子DNA提取微量样品DNA提取石蜡组织DNA提取头发DNA提取提取扩增一步法DNA提取扩增DNA一步法

16、DNA原理: 综合微量样品基因组DNA提取和高效的PCR扩增试剂。从毛发、石蜡组织等微量组织中高效提取足够 浓度的DNA,然后进行PCR扩增。操作简单、方便,可对大量样品同时进行操作。保证基因组保证基因组DNA DNA DNA的完整性和纯度的完整性和纯度 提高提高DNA DNA DNA的洗脱效率的洗脱效率基因组基因组DNA DNA DNA分离纯化中的注意事项分离纯化中的注意事项 DNA DNA的储存的储存保证基因组保证基因组DNA DNA DNA的完整性和纯度的完整性和纯度提高提高DNA DNA DNA的洗脱效率的洗脱效率基因组基因组DNA DNA DNA分离纯化中的注意事项分离纯化中的注意事

17、项简化操作步骤,缩短操作时间DNA DNA的储存的储存减少物理因素对DNA的降解,震荡、搅拌等减少化学物质对DNA的降解,操作多在pH4-10防止基因组DNA的生物降解:DNase保证基因组保证基因组DNA DNA DNA的完整性和纯度的完整性和纯度提高提高DNA DNA DNA的洗脱效率的洗脱效率基因组基因组DNA DNA DNA分离纯化中的注意事项分离纯化中的注意事项洗脱液65度预热10分钟DNA DNA的储存的储存洗脱体积不小于30L 洗脱2次或者3次保证基因组保证基因组DNA DNA DNA的完整性和纯度的完整性和纯度提高提高DNA DNA DNA的洗脱效率的洗脱效率基因组基因组DNA

18、 DNA DNA分离纯化中的注意事项分离纯化中的注意事项可长期储存于pH=7.0的ddH 2O或TE DNA DNA的储存的储存不易制成干品储存分装低温保存不同样品核酸提取、不同样品核酸提取、扩增扩增、荧光定量PCR 完美解决方案-Real-time qPCR 攻略北京百泰克生物技术有限公司北京百泰克生物技术有限公司(北京市海淀区上地信息路北京市海淀区上地信息路151515号号主要内容RT-PCR原理应用Real-time qPCR原理及应用Real-time qPCR成功关键Real-time qPCR数据分析Real-time qPCR常见问题及解决方案中心法则与中心法则与RT RT RT

19、、PCR DNAPCRRNART逆转录反应可以以随机引物、oligo(dT或基因特异性的引物(GSP起始。提取RNA的质量会影响到RT的产量及反转录原理cDNA的完整性。整个过程要求无RNA酶操作。 反转录酶、RNA酶抑制剂都会对产物的质量造成一定的影响。One step RT-PCR实验对比One step RT模板:使用BioTeke公司的RNApure 总RNA提取试剂盒提取的鸡肝脏组织RNA 目的片段:目的片段:管家基因-Actin反应体系:体系:反应程序程序:PCR PCR反应原理本质反应原理本质反应原理本质:酶促反应材料材料:模板模板、引物引物、四种四种dNTP dNTP dNTP

20、和和DNA DNA聚合酶聚合酶原理步骤步骤:高温变性高温变性、低温退火低温退火、适温延伸 多次反复循环多次反复循环,DNA DNA 以指数方式扩增以指数方式扩增影响因素PCR影响因素PCR引物Taq DNA polymerase镁离子浓度dNTP 浓度循环参数甲酰胺酶的差别主要酶的差别主要: 特异性DNA DNA聚合酶选择是聚合酶选择是聚合酶选择是PCR PCR PCR成功的关键成功的关键类别酶特性扩增长度2k/格保真性 1 /格Taq 保真性耐热性扩增效率扩增长度Taq plusLA-Taq pfuPower Taq DNA polymerase :普通聚合酶Power Taq plus DNA polymerase:保真较高的