共聚焦激光扫描显微镜技术_许险峰

1、第12卷第2期2003年4月Vol. 12 No. 2A pr. 2003激光生物学报ACTA LASER BIOLOGY SIN ICA?专题综述?共聚焦激光扫描显微镜技术许险峰，徐锡金，霍霞*(汕头大学医学院中心实 验室，中国广东 汕头 515031)摘 要：自1985年共聚焦激光扫描显微镜问世以来，该项技术一直在飞速发展和完善。近年来一系列新型的共聚焦显微镜相继研制成功和投入使用，如视频共聚焦激光扫描显微镜、双光子显微镜、4pi显微镜、荧光寿命成像显微镜等，它们较传统共聚 焦显微镜有着各自 独特的优势，了解它们的基本性能和特点有助于其在生物学领域更为广 泛深入的应用。关键词：共聚焦激光扫

2、描显微镜；视频；双光子；荧光中图分类号：Q631文献标识码：A文章编号:1007-7146 ( 2003) 02-0156-04The Tech nique of Con focal Laser Scanning Microscopy*XU Xian-feng, XU Xi-jin, H UO Xia(Central Laboratory, Shantou University Medical College, Shantou 515031, Guangdong, China)Abstract : Since the intro duction of Confocal Laser Scanni

3、ng M icroscopy(CL SM) in 1985, it has been developed and impr oved incessantly. On the base of conventio nal CL SM, a serials of new types of micro scopes have been developed. such as video- frequency microscopy, two-phot o micr oscopy, 4Pi microscopy, Fluor escence lifet ime imaging micro scopy and

4、 so on, which process especial advantages respectively. 11 is helpful for their uses in biolog ical investigat ion to acknow ledge the basic capabilitiesand character of these microscopes.Key words : Confo cal L aser Scanning M icroscopy; video-sequence;t wo-photon; fluorescence共聚焦激光扫描显微镜(Con focal

5、Laser Scanning Microscope, CLSM )是 80 年代发展起来 的分子细胞生物学分析仪器，它是随着激光，视频，计算机等技术的飞速发展而诞生的新一代显微 镜1- 3。较传统显微镜有着不可比拟的优势，如高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、 实时动态等细胞结构和功能的分析检测，1- 4这项技术从问世至今一直处于不断发展进步中。1共聚焦激光显微镜的发展简史1957年，Malwin Min sky在他的专利中首次阐 明了共聚焦激光扫描显微镜技术的基本原理2。10年后，Egger第一次成功地用共聚焦显微镜产生了 一个光学横断面，所用的共聚焦显微镜的核心是尼收稿日期：

6、2003-01-23 普科夫盘(Nipko n disks)，此盘位于光源 和针孔之 后，从盘射出的光束以连续的光点在盘旋转时照到3物体上，但该技术尚不完善。1970年,Sheppard和Wils on共同推荐了一种新型的扫描共聚焦显微镜，同时首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线 性关系和 激光扫 描器的 拉曼光 谱学5。1978年， Brankenho ff发明了高数值孔径的透镜 血。1979年， Ko ester设计了一种共聚焦扫描狭缝器，获得美国专利。1985年,Wiijanedts第一次成功地用共聚焦 激光显微镜演示了用荧光探针标记的生物材料的光 学横断面，至此,共聚焦激光显微镜的

7、关键技术已基 本成熟7。1997年我院购进了一台美国M eridian公司生产的ACAS U LT IMA 3 1 2型共聚焦激光扫描显微镜,其采用氩离子激光光源，有快速镜扫描和台Mishing House. All rights reserved, htrp. nc 第2期许险峰等：共聚焦激光扫描显微镜技术159阶扫描两种扫描方式，具有三个探测器，可以同时检 测多种荧光，可进行组织细胞荧光图像分析，连续光 学切片，三维图像重建，活细胞分子、离子等时实动 态荧光测定，膜电位检测，膜流动性、细胞间通讯的 荧光光漂白恢复技术，细胞的自动检测、筛选，显微 切割、光活化、光陷阱技术等，为同类仪器中档次

8、最 高、功能最全的精密仪器之一 8,9。2视频型共聚焦激光显微镜共聚焦显微镜的扫描方式几经发展，起初是狭缝扫描，但图像的清晰度和质量都不是很好，后来又 出现台阶扫描，即光束不动载物台移动，特点是光学 系统稳定，成像质量好，但扫描速度慢，不适于实时 动态观察。目前使用最广泛的是镜扫描，即移动光束 而样本台不动，特点是扫描速度快但成像质量不如 台阶扫描。从激光共聚焦显微镜的发展过程来看，成 像质量与扫描速度始终是相互矛盾的。为了提高扫 描速度，同时保持高分辨率和宽广的视野，增强传统 CLSM的功能，近些年来，不断有新的显微镜技术或 相关技术与共聚焦探测方法联合应用，出现了几种视频CLSM，这类CL

9、SM 可至少以15Hz30Hz的 速率扫描大于480帧的图像，其采取的改进措施有：(1) 双向扫描(台阶扫描与镜扫描结合)；(2)狭缝式 共聚焦孔径；(3)声.光调制装置(AODs) : ( 4)共鸣 检流计10。其中计算机控制的声光调制器 (AODs) 可对细胞的极小区域作毫秒级的瞬间激光脉冲扫 描,较好地解决了荧光漂白、淬灭等问题，通过这些方法瞬时分辨率大大增加。此外,为了能得到生物样 本内部深层横断面精确的分辨图像，出现了更长工作距离的水浸透镜，Nikon和Zeiss公司分别推出其 专利产品“水镜”，Zeiss公司推出的C - Planap063X/ 12W水镜有一调 节环，可修正因水浸

10、 活体的不同深度所带来的球差，该水镜紫外通过率 高,大大提高了成像质量1'。3荧光寿命成像共聚焦激光显微镜到90年代，荧光寿命成像显微镜 (Fluorescenee Lifetim e Imag ing Microscope)与 CLSM 的联合应 用,大大改进了传统的共聚焦成像，其核心结构是一个增益调节影像增强器和一个慢扫描CCD摄像 头12。荧光寿命成像显微镜能追踪观察1纳秒10纳秒范围内荧光寿命的荧光团。用这种显微镜产生的影像对比是基于被测荧光的寿命，而不是荧光的浓度或强度，因此其产生的荧光寿命图像反映的是活细胞内的随时间变化的动态反应而非静态变化。 相比传统显微镜，这种时间控制

11、的观测方式在活细 胞动态测定方面有以下几个优点:(1)定量检测过程不需要复杂的活细胞体内校正；(2)仅用一个探测器就可以检测多种荧光；(3)背景荧光信号分辨率增 加；(4)对于一些因素如光漂白、 不同染色/光程的伪 像等相对不敏感；(5)由于所有观测点的信息同时被 收集，因此扫描图像不必像传统 CLSM那样逐点扫 描12； (6)不需要荧光探针有发射或激发光谱的改 变，因而扩大了荧光探针的应用范围。荧光的寿命对于物理或化学因子比较敏感，所以这种技术适合于 pH、氧、阳离子等的测量。但这种显微镜也存在尚未 克服的缺点。根据其原理，荧光寿命是通过检测激发 状态下荧光物质量子产额的改变而确定的 ，而

12、活细 胞体内反应有时会导致荧光猝灭的发生。因此,所测得的"荧光寿命”就有可能是由于荧光量减少或淬灭 所致,而并非荧光寿命真正发生了变化，对此目前尚无理想的解决方法。4双光子共聚焦激光显微镜对传统CLSM改良中应用最广泛的就是双光 子激发13。双光子方法就是利用相对复杂和昂贵的激光束产生超短期(毫微微秒)、高强度的照射，以一 种非线性方式激发标本内荧光探针，使足够密度的光子到达样本的焦平面上。例如in do-1标记的样品 被705nm的激光束照射可以吸收 2个光子，这与用 单一 355nm紫外光子照射激发作用相同。与传统的 CLSM相比，双光子共聚焦激光扫描显微镜(Tw 0-photo

13、Excitati onCon focalLaser ScanningM icr oscope)有以下几方面的优点：(1)使用可见光 而不是更有害的紫外光，降低了光的毒性作用；(2) 将光漂白限定于光束焦点，而不象传统CLSM在共 聚焦点的上下形成广泛的照射光锥；(3)减少背景荧光。目前常用发出蓝宝石激光钛作为双光子显微镜 激发光源，最近又有人用发射镁橄榄石样激光的铬 代替钛做激光光源，后者较前者具有功率大、稳定性 高、光脉冲宽度短等优点14。双光子技术的另一个 优势是增加了对生物样本成像的深度13,即可以观察较厚的生物样本，因为在双光子激发中使用了长 波长减少了散射，而且双光子共聚焦显微镜用红

14、外 线代替紫外线激发荧光剂，极少造成样品或双光子 激发通路以外荧光分子的淬灭，故这种成像方法在 对样品观察深度增加一倍以上时仍可以取得高信噪 比图像13。双光子技术的缺点(激光复杂昂贵、横向分辨率降低)可以由其优点(信噪比和组织穿透性增 加)来抵消，可商业运做的双光子 共聚焦显微镜 (BioRad M RC. 1024MP; Leica T CS MP; DeerfieldlL; Zeiss NLO; Thomwood NY)已经投入 使用，双光子共聚焦激光扫描显微镜的主要优势在 于活细胞结构和功能的实时动态变化过程的分析检 测13。双光子技术开创了钙动态分析的非线形相关的 检测方式，它的出现

15、使人们看到钙离子活动的更细 微形式“钙微粒”。钙微粒”是目前发现的心肌钙信 号系统的最小功能性释放单位15。不仅如此，先进的CLSM技术与膜片钳技术的结合,甚至能让人观 察到少量的钙离子是怎样通过膜上的L.类钙通道和肌质网释放通道来控制肌质网对钙的释放16。5 4Pi共聚焦激光显微镜双光子显微镜之后，4pi显微镜的出现大大增 强了共聚焦显微镜的分辨率，它是在双光子显微镜的基础上在一般的共聚焦光路上引入12个相对立的高数值孔径物镜，以增加光线收集器的角口径。 改进后的显微镜与传统的CLSM相比,其空间分辨率大大增加，可达到100nm140nm的范围，是普 通共聚焦显微镜分辨率的37倍17。但这种

16、方法在实时动态成像上，因为荧光信号相对较弱，所得图 像不够清晰。最近有用水浸透镜同 4Pi型显微镜相 结合的方式，解决了荧光信号较弱的问题，使得这类 显微镜也能够用于活体标本进行实时动态监测 18。6多焦点多光子共聚焦激光显微镜虽然双光子共聚焦显微镜使共聚焦成像产生一 个质的飞跃，但其扫描速度相对较慢,最近出现的多 焦点多光子显微镜(Multifo cal M ultiphotonM icroscope)较好地解狭了这一问题，其设计新颖的 分光镜系统可以产生多重高穿透性的激光束 ，从而 产生多个焦点，不同的焦点互不干扰，因为不同的激 光束之间有一个短暂的时间延搁。与以前的单焦点高了检测速度。由

17、于检测时间相对的缩短,进一步降低了荧光剂对样品的毒性作用19, 20。成像相比，利用这种技术能够同时扫描视野中的多 个点,克服了双光子显微镜逐点扫描的缺点，大大提光产生效率，可使其用低强度的激光照射，减少了样品的光漂白，从而更有利于实时动态的长期分析。将这种提高后的光学效率与快速扫描CLSM相结合，可以提高四维分析即长时间动态的三维成像能力。 处理四维数据的软件已经用于细胞内各种时实动态 变化的分析。假若因焦点深度增加而信号衰退的问 题可以用适当的方法解决的话，这种方法可用于配子、卵子等较大细胞内的钙变化追踪。四维数据将会应用于描述各种细胞内动态反应(如钙波动)空间特征的数学模式，反过来这些数

18、学模式可以对以往靠 经验观察的图像提供更深入的阐述。以上是近年来陆续出现的新型共聚焦激光显微 镜,尽管共聚焦激光显微镜的出现仅有十余年的时 间，但由于其独特的激光扫描成像方式及精确的计 算机测量定位系统，使其在各个学科领域发展非常 迅猛。由于CLSM新型功能和相关技术不断涌现，且价恪昂贵，了解该技术的基本知识，将有助于其引 进、推广和应用。Refere nces1 WHIT E JG, A M OS WB. Confocal m icroscopy comes ofageJ . Nature, 1987,328(6126) : 183-184.2 M I NSKY M. Memoir on i

19、nventing me confo cal scanningmicroscopeJ .Scanning, 1988, 128- 138.3 EGGER MD. The development of confocal microscopy J .TINS, 1989, l 2: 1 1.4 HU O Xia, LU Jian-xun, YANG Ren-dong, et al. Comparation of Laser Scanning Confocal M icroscopy with light microsopy J. Acta Laser Biology Sinica. 2001, 10

20、( 1): 76-79( in Chinese).5 WIL SON T. Three-dimensionalimag ing in confocal systems J . J M icrosc, l989, 153( pt 2): 161. 169.6 BRA KEN HOFF GJ, VA N-DER. VOORT H T , VAN- SPRONSEN EA , NANN INGA N. Thr ee-dimensio nal imaging in fluor escence by confocal scanning micr oscopy J. J M icrosc, 1989,15

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22、l Colleg e,2001, 1 4(3): 174-176( in Chinese).第2期许险峰等：共聚焦激光扫描显微镜技术#7其他促进共聚焦显微镜动态成像的技术还有其他一些技术也可促进共聚焦显微镜动态 成像,如增加传统CLSM或转盘型共聚焦显微镜的8 HU O Xia, L U Jian-xun, YA NG Ren-dong, et al. Study of optical sections and F-actin in amnion of early human embryo with Confocal Laser Scanning MicroscopyJ.A cta Anato

23、mica Sinica, 2002, 33 ( 3): 283-287 ( inChinese).9 FAN GY, FU JISAKI H, MIY AWAKI A, et a1. Videorate scanning two-photon excitation fluorescence microscopy and ratio imaging with cameleons J. Biophys J, 1999,76(5): 2412-2420.10 DUFFY PM, HAYES MC, GAT REL L SK, et a1. Determination and reversal of

24、resistance to epirubicin int ravesical chemotherapy. A confocalimaging study J. Br J U rol, 1996, 77(6) : 824-829.11 TADROUS PJ. Methods for imaging the str ucture and functio n of living tissues and cells: 2. F luo rescence lifet ime imaging J. J Pathol, 2000,191(3):229- 234.12 PISTON D W. Imaging

25、living cells and tissues by two- phot on excitatio n micr oscopy J. Trends Cell Biol, l999, 9(2) : 66- 69.13 LI U TM , CHU SW, et a1. Multipho ton confocal micro scopy using afemto second Cr:for sterite laser J. Scanning , 2001,23( 4): 249-254.14 DELPRIN CIPE F, EGGER M , NIGGLI E. Calcium signallin

26、g in cardiac muscle: refractoriness revealed by coherent activation J. Nat Cell Bio 1, 1999, 1( 6): 323329.15 KONI SHI M ,YAM ASHIT A T,NAKAYAMA S,et al. Calcium waves in skinned cardiac myocytes evoked by two. photon excit ation photo lysis of caged calcium J. Jpn-J-Physiol, 2001,51( 1): 127-132.16 KANO H, JAKOBS S,NAGORNI M , HELL SW. Dualcolor 4Pi-confocal micro scopy wim 3D -resolutio