共聚焦应用资料

1、共聚焦显微镜成像图库成像质量可能是评价任何光学仪器性能优劣的最合适的标准。这个图库包括了FV300和FV500在各种实验条件和扫描模式下拍摄的荧光图片。其中有几种情况，是未经过后期加工果蝇成虫脑部的光学截面扫描数据经过三维重建和其他技术处理所得到的。-这一节的附图表示的是果蝇(melanogaster)成虫脑部通过共聚焦显(mushroom body)被绿色荧微镜光学截面扫描，再进行三维重建所得图像。样本中的蕈形体光蛋白GFP标记，绿色荧光部分非常突出。该图由东京都大学细胞遗传学院的Toshiro Aigaki提供。如他们的名字一样，果蝇在他们的自然生活环境中以在腐烂变质的水果和蔬菜中存在的细

2、菌和酵母为食。由于他们常常侵食重要的经济农作物，如草莓和土豆等，这些小生物通常被认为是农业害虫。然而在实验室体系中，果蝇则有另外的用处。由于繁殖和饲养非常简单，常 见的果蝇被认为是一种最理想的实验材料。在过去50多年里，它已经被广泛利用于细胞和分子遗传研究，最近更成为发育生物学研究的基础物种(cornerst one species)。蕈形体是high-order sensory assimilation和果蝇及其他昆虫研究的关键中心。通过利用共聚焦显微镜技术，特别是光学截面扫描、荧光标记和三维成像技术，现代对这些蕈形体的认识已经有了大幅度提高，这些方法也提供了极大量的果蝇其他方面显著的解剖学

3、、生物学和生理学信息。此外，这些发现被结合起来，为更高层次的研究创造严谨的科学资源，如触须突触和其他微细结构的三维图，中央和周围神经系统的及其细致的神经解剖图，而且如果不使用共聚焦仪器， 互动虚拟解剖程序in teractive virtual dissection programs不可能得以实现。斑马鱼晶胚中的荧光蛋白表达-在双重、三重荧光标记试验中，或使用特殊的激光系统定位荧光表达的试验中，GFP蛋白的光谱多样性相当有用。这一节的附图是用红色荧光蛋白(dsRED)标记的斑马鱼晶胚作5卩m连续光学截面所得的三维重建图。该图由日本大阪大学分子细胞生物所的Yasuhiro Kamei和Shuns

4、uke Yuba提供。斑马鱼是一种体形小、耐寒的鱼类，存在一系列广泛的遗传突变体。标准“野生型”有些透 明并且全身有纵长的黑色斑纹。虽然在热爱家庭养鱼的人士中也非常受欢迎，但是斑马鱼作为脊椎动物发育学、遗传学和疾病研究的模型可能才是最重要的。斑马晶胚在母体外发育， 非常适合用于科研目的，并且从1970年代已经在世界各实验室广泛应用。由于饲养、操作和观察都很简单，可以利用斑马鱼和它的晶胚所获得的知识非常多。共聚焦显微镜和荧光探针的发展完善了至关重要的斑马鱼晶胚数据积累。例如共聚焦技术， 它已经能够在不需考虑厚度的前提下捕捉到斑马鱼样品的高分辨率图像；而荧光标记促进了对细胞个体行为在分裂和发育全过

5、程中的追踪技术。这些显微工具在了解各种基因突变体的信息方面作为辅助工具同样非常有价值。对于在人类和其他脊椎动物中出现的类似的问题， 这些信息有无可比拟的作用。-用Alexa Fluor488 （绿色荧光）和 TO-PRO-3 （红色荧光）双重标记,该图由犹这一节中人结肠腺窝的激光扫描共聚焦显微镜图像展示了非常显著的解剖学细节。他州 Huntsman 癌症所 Ray White 实验室的 Christine Anderson 提供。结肠是脊椎动物消化系统的一部分，是指大肠中从盲肠到直肠的部分。在人类当中，结肠的基本功能是分泌润滑液和贮存排泄物，同时吸收残留的盐分和液体。跟其他中空器官类似， 结肠

6、由四层组成：粘膜上皮细胞，粘膜下层，肌膜，和外膜（或浆膜）。称为腺窝的管状腺体延伸贯穿这四层膜。在腺窝底部的活性干细胞负责更新肠上皮细胞，这些上皮细胞是由几种不同类型的细胞组成的高代谢dynamic组织。对结肠的研究很重要，这种研究在促进我们获得基础解剖学信息中扮演重要角色，同样对我们认识各种肠疾作出了重要贡献。共聚焦显微术和荧光探针对这些研究起了很大帮助作用，主要由于共聚焦能够对厚标本进行观察并保持高分辨率的能力、蛋白和其他类结肠结构的标记法、还有对细胞和组织的三维成像技术。例如结肠腺窝，它是半透明的，对荧光激光扫描共聚焦显微分析有 独特的反应（particularly amenable）。

7、它们在这种方法下的分离和检验显示 出腺窝和腺窝周边的结构与功能对应关系的显著信息，-这一节的插图是一厚层的活性人皮肤组织，用水浸物镜以红外微分干涉法（IR DIC）观察约80卩m厚度所得。该样品由一个近红外激光系统以750nm光作照明。这张引人瞩目的照片展示了激光扫描共聚焦显微镜与传统增大反差技术相结合所蕴涵的能 力。主要由两层组成的皮肤是起保护作用的柔韧的组织，它覆盖着人类和其他脊椎动物的身体。 表皮层是皮肤的薄的外层，基本上由紧密排布的细胞组成，而里层更厚一点的真皮层则主要由包含神经末梢、腺体、和血管的纤维性结缔组织所组成。这两层皮层共同作用形成一道屏障对抗外源的干扰，如细菌和辐射，并帮助

8、维持体内适当的水分，罩护体内器官不受外来的 物理伤害，还能帮助维持正常体温。其非凡的复原能力，表现在当它们受到损伤时通常都能 够自己愈合。共聚焦的显微方法可能使历来皮肤组织的研究获得了最大的进步。通过促进对厚标本和活细胞的检验，科学家们已经获得对外皮系统更为高级的认识，这在以前是无法企及的。这种技术引起了全世界的皮肤学者和研究员们极大的兴趣，它已经被广泛应用于各个领域。 其中包括生理学研究，皮肤癌研究，各种外皮治疗的监测，皮肤脉管系统的实时成像，还有护肤品 的体内实验。UlR鼠海马神经元-海马神经元表达一种GFP标记的突触后密度蛋白postsynaptic density protein （绿

9、色），这一节的图中这种蛋白经由若丹明-phalloidin固定染色后显示出胞质肌动蛋白丝（红色）的位置。在树枝状细胞质突起中，肌动蛋白丝集中在后突触postsynaptic 的位点。这张照片由日本东京医学和齿科大学解剖细胞生物学部的Shigeo Okabe提供。脑皮层下的海马是脑边缘系统的一部分。其结构呈马蹄铁型，对于一个人的情绪、性征和空间识别能力起着很重要的作用。然而最重要的是，海马有效地参与记忆的形成，研究已经表明该部位的损伤会导致无法记住即使是刚刚出现的人或事。有些科学研究表明，海马的这种重要功能与神经形成紧密相关， 神经形成是指形成新神经元或神经细胞的能力。 虽然这种能 力曾经被认为

10、在成体脊椎动物中是没有的，但是越来越多的证据显示， 神经形成在正常脑部的海马中是持续发生作用的。共聚焦显微技术在海马的现代概念发展中起着非常重要的作用。通过利用该技术和各种荧光标记联合起来，研究员已经能够获得关于脑的这个区域在形态和功能方面非常珍贵的信息。例如某些研究已经使用共聚焦显微技术获取精确分离的海马神经元在时间和空间上的高分 辨率图像，而另外一些研究则区分了神经轴突和树枝状延伸过程，也研究了他们在突触传递中扮演的角色。例如能够进行光学截面的三维成像和重建这类非常有用的显微方法同样会有 力地促进神经元研究领域未来的发展。普通杆状线虫Caenorhabditis elegans) - Ca

11、enorhabditis elegans是一种在地球上气候温和地区都能发现的线虫，现已广泛用于遗传学、发育学和神经生物学的研究。这一节的附图描述了线虫中一种可遗传的改良/修饰（modified）突变体，该突变体中作为一种线虫，Caenorhabditis elegans是一种外皮光滑、无分节的蠕虫，最常被提到的一种 是蛔虫。说到体形小，虫体只有大约1mm长，两头是锥形的。自然界中，Caenorhabditis elegans 生活在泥土里，常伴有腐烂的植物为它提供细菌作为食物。然而，线虫作为一种实验室材料，以细菌为食饲养在皮氏培养皿中，可能更为大家所熟悉。据世界各国科学家研究，线虫拥有人类和其

12、他高级生物的很多基本生物学特征。然而在1998年测序完成的该生物的基因组只包含9千7百万碱基，多于3000个基因与人类基因相似。(The organism ' s genome, however,which was completely seque need by late 1998, comprises only 97 megabases, rather tha n the 3000 associated with the human genome.)在关于Caenorhabditis elegans的极大量科研数据的积累工作中，共聚焦显微技术处于中心地位。事实上，该技术能对厚标本提

13、供高分辨率图像的无比卓越的能力，还有它通过光学截面创造精确的非常细致的三维图像的能力，已经在对蛔虫的研究中变得至关重要。此外，当我们把共聚焦技术和荧光探针技术结合起来，就可以揭示这种生物机体在解剖学特征方面弥足小鼠小脑浦肯雅细胞珍贵的信息，如核孔复合体结构；当与延时摄影结合则可以揭示重要的功能方面的详细资料， 如与神经系统发育有关的过程。这些发现结合起来，展现了深藏在层层神秘面纱背后的现代 生物学。-鼠小脑中的Purkinje cells以双重荧光策略(a dual fluorophore strategy)进行固定，从而产生了附图中漂亮的共聚焦图像。荧光素异硫氰酸盐(FITC)作为绿色荧光探

14、针，用于标记小泡状丫酪氨酸载体transporter (VGAT)，而Red Cy3OOOOOOOOO用于标记小泡状谷氨酸载体(VGLUT1)。该图由。位于脑桥和延髓下方的 cerebellum (小脑)在拉丁文中意为"little brain”，是在脑底部的一 个三裂叶状组织。它的基本功能是调节和控制复杂的自发肌肉运动，如跑步和跳跃。要实现这种功能，小脑必须能够流畅地协调来自身体个部分的信息，包括眼睛、耳朵、肢体和大脑。小脑的表面是沟槽，由灰质组成，而内部结构则由白质组成。在这些层次里面包括 5种不同 的神经细胞，但是其中只有分支的浦肯雅细胞伸出轴突到小脑外。对于研究浦肯雅细胞和其

15、他神经组织的成分，共聚焦显微技术是最理想的工具，因为它能帮助检验如脑切片(brain slice )等厚标本。例如，利用该技术和多种荧光染料结合，研究者 能够成功地研究在小脑 切片(slice)中的钙信号和突触传递，从而捕捉GABA介导的单个神经元胞内氯化物改变成像，并观察经过甲状腺激素处理的浦肯雅细胞的形态学变化。共聚焦光学切面技术促进了类似的科研发现，该技术可以用作建立神经系统极其细致的三维解剖学图像。-小鼠舌的厚截面通过核酸荧光染料DAPI、荧光素异硫氰酸盐FITC和Texas Red进行三重染色，从而得到附图中引人瞩目的共聚焦图像。图中细胞核发亮蓝色荧光，而脑源嗜神经组织因子的一种高亲

16、和力受体则被染成绿色。遍布组织的蛋白基因产物以常用的rhodamine衍生物染成红色。该图由。在哺乳动物中，舌头的基本功能是作为味觉的机构，虽然它对于人类讲演、婴儿哺乳、吞食、和某些动物的自我清洁也很重要。这个由散布着腺体和脂肪的大量横纹肌组成的器官被一层黏膜覆盖着。在这层黏膜的上表面布满大量发射状的细胞的小突起簇，这些细胞称作味蕾，包含。(It is along the top surface of this mucous membra ne that the nu merous project ions called papillae and the clusters of cells c

17、alled taste buds they contain are most heavily located.)每个味 蕾可以包含75个味觉受体，但是在传统上，科学家们坚持只存在 4种味觉受体，每一种感 觉一种味觉：咸、甜、酸和苦。然而现代研究已经表明这种传统观点存在根本缺陷，事实上 味蕾和受体要远比之前观点认为的要复杂得多。在当代对于味觉的重新认识中，共聚焦显微技术已经被频繁利用并获得巨大的成功。该技术特别适合于这种研究，因为它实现了对各种动物的舌头厚切面的检验。同样地，当与荧光标记一同使用，这种方法推动了对样品中的细微结构的辨别和了解，而光学切面和重建过程则能得出精确的三维视像，并得到奇妙

18、的解剖学细节。共聚焦技术正帮助处理该领域内的某些 问题，这些问题包括味道性质的信息是如何被受体细胞获得的，该过程会发生什么电生理学行为，还有味蕾的不同的形态学类型是否真的代表完全不同的细胞类型。Ganglion细胞 -附图中央的视网膜神经节伸出大量突出，被Lucifer荧光素清晰地染成黄色。紧密相连的多巴胺处理的无长突细胞以Texas Red复染。该共聚焦图片由。2视网膜由眼睛内部后方里层的一层薄组织组成，负责收集从晶状体传来的光学信号，并且在把信号传送到更高级的视觉中枢之前对这些信息进行预处理。同样地，视网膜在视觉系统中扮演一种多功能滤镜的角色，它可以分离时间、空间和色彩方面的视觉信号。在互

19、相连接并且遍及视网膜的多层细胞中存在一种层次的组织(a hierarchy of organization)，该组织由60多个种类的单独的神经元组成。神经节细胞位于视网膜最里面的其中一层，在编码和压缩电子信号成为一系列动作电位通过视神经的过程种起到输出缓冲器的作用。研究多种脑组织中神经元和支撑细胞之间错综复杂的结构与功能关系特点，共聚焦显微技术是很有力的工具。例如，使用多种荧光探针，研究者已经成功地在各种动物中标记了视网膜 的突触前端末梢，包括两栖类、哺乳类、鱼类和海龟类。研究活体视网膜标本中染上色的地 方，以检查杆状体和视锥细胞的分布，还有遍及视网膜组织的两级细胞、无长突细胞、水平细胞和神经节细胞。另外，共聚焦显微技术的光学切面能力能用于重建三维图像，阐述视网-给从凤尾蝶获得的视觉中间神经元注射Lucifer黄色荧100卩m焦平面厚膜神经中枢细胞的解剖学构造。光素，便于捕捉附图中的图像。沿样品在光轴上383卩m的范围内，通过度连续截面扫描，得出一幅层叠的拟颜色示意图。该图由。凤尾蝶是昆虫蝶型 (Papilioninae )亚科的一员，以其后翅特有的尾状延伸而闻名。在地球上最炫目的各种生物当中，凤尾蝶展示了非常多样的色彩和斑纹。最容易被辨认的可能是斑马凤尾蝶，