电针对海洛因依赖大鼠海马神经细胞凋亡的影响

1、电针对海洛因依赖大鼠海马神经细胞凋亡的影响        【摘要】  目的：观察海洛因依赖大鼠海马细胞凋亡情况及电针的干预作用,为针刺戒毒提供一定的理论依据。方法:SD大鼠24只随机分为对照组和实验组；实验组按剂量逐日递增原则,每日2次、连续9天皮下注射海洛因，第10天用纳洛酮催促戒断，建立海洛因依赖模型,再经跳台实验测试筛选,分为电针组和非电针组,每组8只动物；非电针组继续给予海洛因维持剂量，电针组停止给药，处于戒断状态,同时选取“百会”、“大椎”进行电针，每天1次，连续7天；采用TUNEL法、Envi

2、sion免疫组化法检测3组大鼠海马区细胞凋亡情况及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的变化。结果:与对照组比较,非电针组大鼠海马细胞凋亡指数显著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01),Bax蛋白表达增加(P<0.01)；与非电针组比较,电针组大鼠海马区细胞凋亡指数显著降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达增加(P<0.01),Bax蛋白表达降低(P<0.01)。结论：电针促进Bcl-2表达、抑制Bax表达，可加速细胞修复、保护损伤脑组织、改善海洛因依赖大鼠学习记忆能力。 【关键词】  海洛因依赖；细胞凋亡；海马；电针The Ef

3、fect of Electroacupuncture on Apoptosis of Hippocampal Neurocyte in Heroin-addict RatsPAN  Li，PAN  Guishu(Department of Cardiology, Baotou Hospital of Tranditional Mongolian and Chinese Medicine, Baotou 014040，China;Department of Physiology, Zunyi Medical College)    Abstrac

4、t  Objective:To observe the curative effect of electroacupuncture (EA) on apoptosis of hippocampal neurocyte, study its acupuncture treatment mechanism and provide some theoretical proofs for EA abstaining from narcotic. Methods: Twenty-four SD rats were randomly divided into the control group

5、and the experimenting group. Heroin was injected subcutaneously twice a day for 9 days, with the dose increasing daily, in rats of the experimenting group. On the tenth day, the withdrawal signs precipitated by intraperitoned injection of naloxone was performed to establish the heroin-dependent mode

6、l. The qualified rats were divided into the non-electroacupunctured group and the electroacupunctured group through the step-down test. Heroin was injected continuously according to the maintenance dose of non-electroacupunctured group, while the electroacupunctured group was no longer given heroin.

7、 Meanwhile, Baihuiand and Dazhui points were chosen for electroacupunture treatment, once a day, for 7 days. Apoptosis of neurocytes in rats' hippocampus was measured with the method of TUNEL; Expression of Bcl-2 and Bax in neurocytes  was measured with Envision immunohistochemical techniqu

8、e and results were analyzed by Imaging Analyzing System. Results: Compared with the control group, apoptosis index (AI) of neurocytes in hippocampus in non-electroacupunctured group was significantly higher, the expression of Bcl-2 decreased significantly, while the expression of Bax increased signi

9、ficantly. Compared with non-electroacupunctured group, apoptosis index (AI) of neurocytes in electroacupunctured group obviously decreased, the expression of Bcl-2 increased significantly，while the expression of Bax decreased significantlyConclusion: Heroin can induce the apoptosis of hippocampus in

10、 rats by up-regulating the protein expression of Bax and down-regulating the protein expression of Bcl-2；Electroacupuncture can inhibit the apoptosis of hippocampus induced by heroin by up-regulating the protein expression of Bcl-2 and down-regulating the protein expression of Bax. Also, electroacup

11、uncture can obviously improve the ability of learning and memory     Key words  Heroin-dependence；Apoptosis；Hippocampus；Electroacupuncture海洛因为二乙酰吗啡，海洛因依赖在世界范围内成为一种严重的社会公共卫生问题，而其中枢机制则是解决临床预防和治疗的关键，但至今仍不清楚。脑内与学习记忆密切相关的结构如皮层和海马等，参与药物精神依赖的形成。脑功能成像研究表明，阿片成瘾戒断者通过回忆欣快经验引发心理渴求时，脑内与学

12、习记忆有关的脑区如前额叶、海马、杏仁核等代谢活动明显增强。已有证据表明,皮质和海马直接参与信息的贮存。目前的研究证实了海洛因依赖致脑损伤中有细胞凋亡的存在，并且有依据表明调控神经细胞凋亡可减轻海洛因依赖脑损伤的程度。本实验旨在探讨细胞凋亡调控基因Bcl-2和Bax在海洛因依赖大鼠海马的表达以及电针对其表达的影响，为进一步探讨海洛因依赖的学习记忆机制提供理论依据。1  材料与方法1.1  材料  实验动物选择健康SD大鼠24只，雌雄不拘，体重180220g，由重庆第三军医大学动物实验中心提供（生产许可证号SCXK(渝)20020003）。大鼠分笼饲养,自由饮水、进食

13、。1.2  试剂与仪器  海洛因(纯度61.48%,贵州省公安厅提供),盐酸纳洛酮注射液(湖南益桥制药有限公司)，原位细胞凋亡检测试剂盒(German Roche Company),Bcl-2和Bax蛋白免疫组化试剂盒（Bcl-2/N- 19,sc-492；Bax/P-19,sc-7480,美国Santa Cruz公司）；DAB显色试剂（Sigma公司）。LH-402型韩氏穴位神经刺激仪(北京力普康医药科技公司),石蜡切片机,细胞图像分析仪(German Leica Company)。1.3  方法  选择健康SD大鼠24只,随机分成对照组和实验组,对照

14、组8只，实验组16只。实验组大鼠参照潘贵书1的方法建立海洛因依赖大鼠模型：按逐日递增海洛因3mg/kg的原则，首日每次剂量3mg/kg,2次/天（上午9点，下午4点），连续皮下注射9天，第9天每次剂量达27mg/kg，第10天腹腔注射5mg/kg纳洛酮，诱发戒断症状并与已建立的海洛因依赖大鼠模型戒断标准比较，确定模型是否建立成功；对照组按同样方法注射等量生理盐水。海洛因依赖模型建模成功后，经跳台实验测试分为电针组和非电针组,每组8只动物。非电针组继续给予海洛因维持量27mg/kg，1次/天，连续7天。对照组按同样方法注射等量生理盐水。电针组根据针灸学会实验针灸研究会制定的动物针灸穴位图谱2选取

15、百会、大椎穴进行电针(HANS)治疗，百会穴(顶骨正中,两耳尖连线中点,向前平刺2mm)用1.5寸毫针刺入深度为0.50.8寸，行提插捻转平补平泻手法，大椎(背部正中，第七颈椎与第一胸椎之间，直刺3mm)进针后，顺着经脉走向进针，不进行手法刺激，接韩氏穴位神经刺激仪，施以连续波，波宽0.3ms，频率2/100Hz，疏密波交替，电压24伏，强度以大鼠能安静耐受为度。刺激强度采用1mA、2mA、3mA逐渐递增法,每10分钟更替1次,刺激持续时间为30分钟。每天1次，连续治疗1周。1.4  各指标测定1.4.1  标本选取与制备  实验结束后,大鼠经25%氨基甲酸乙酯(

16、4mL/kg)腹腔注射麻醉，剖开胸腔，左心室近心尖处插入灌流针头，先以生理盐水100mL快速冲洗，再用40g/L多聚甲醛(0.1mol/L磷酸盐缓冲液配制,pH7.4)300mL先快后慢灌注固定，取脑组织入上述固定液固定24小时。对照组大鼠按脑立体定位图谱3，取包含海马和皮层的脑组织块，常规经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后石蜡包埋，连续冠状切片，片厚5m，进行HE染色，观察海马细胞的形态变化。原位TUNEL法检测细胞凋亡情况；免疫组化Envision法检测Bcl-2和Bax蛋白的表达；操作按试剂盒说明进行。1.4.2  结果判断  TUNEL染色：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细

17、胞，即凋亡细胞。免疫组化：胞浆或胞核中有棕黄色颗粒者为Bcl-2、Bax阳性细胞。图像分析：每组于40×10高倍镜下随机选取不同脑区的510个视域，用图像分析系统进行定量分析。以0.201m象素点长，在1.769×104m2测量窗下，测量棕黄色反应物信号的积分光密度来分析Bcl-2、Bax 蛋白表达的水平。凋亡细胞计数：采用镜下直接计数，在40×10倍的光镜视野下，计数各组海马区的510个视域中凋亡细胞的个数占整个视野细胞总数的百分比，以平均值为细胞凋亡发生率(凋亡指数)。1.5  统计学方法  采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析和

18、两两比较。2  结果2.1  组织形态学观察  对照组大鼠海马锥体细胞及颗粒细胞排列紧密，层次丰富，结构清晰，胞浆丰富；非电针组细胞排列疏松，层次紊乱，细胞缺失较多，部分细胞核浓缩深染，胞浆皱缩；电针组细胞排列较整齐，结构较清晰,见图1。图1  海马DG区HE染色 (×400)（略）1A:对照组  1B:非电针组  1C:电针组2.2  海马细胞TUNEL染色  TUNEL阳性细胞胞核呈棕黄色,胞浆不着色,染色质呈块状凝集或裂解成颗粒状,使圆形胞核致密深染或见多个细小颗粒聚集。对照组海马CA区、CA3区、

19、齿状回（DG区）可见少量TUNEL阳性细胞,且着色浅淡；非电针组可见较多阳性细胞，细胞排列稀疏，细胞间隙增大，突起明显减少,部分有核固缩及染色质边集现象；电针组凋亡细胞数目较非电针组减少,核固缩及染色质边集现象少见,见图2。图像分析结果表明,非电针组海马神经细胞凋亡指数(AI)比对照组明显升高(P<0.01),电针组细胞凋亡指数(AI)比非电针组明显降低(P<0.01),但与对照组比较仍有差异(P<0.05），见表1。 图2  海马DG区TUNEL染色 (×400)（略）2A:对照组  2B:非电针组  2C:电针组表1

20、60; 三组大鼠海马各亚区TUNEL染色神经细胞凋亡指数AI比较（略）*与对照组比较P<0.05；*与对照组比较P<0.01；#与非电针组比较P<0.011           2.3  免疫组织化学染色  Bcl-2蛋白表达，阳性产物位于细胞浆及突起，呈棕黄色，主要见于锥体细胞，胞核着染呈阴性或轻度着染，两者之间分界明显，见图3和图4。Bax蛋白表达，阳性产物位于细胞核，呈棕黄色，胞浆阴性,见图5和图6。图像分析表明,Bcl-2蛋白在对照组呈高表达,非电针组较对照组

21、表达明显降低（P<0.01),电针组较非电针组表达增高（P<0.01),但与对照组比较仍有差异(P<0.05),见表2。Bax蛋白在对照组呈低表达,非电针组较对照组表达明显增高(P<0.01),电针组较非电针组表达降低(P<0.01),但与对照组比较仍有差异（P<0.05),见表3。3组大鼠海马DG区未见Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达,无统计学差异(P >0.05)。图3  海马CA1区Bcl-2蛋白表达(IHC×400)（略）3A:对照组  3B:非电针组  3C:电针组图4  海马CA3区Bcl-2

22、蛋白表达(IHC×400)（略）3D:对照组  3E:非电针组  3F:电针组图5  海马CA1区Bax蛋白表达(IHC×400)（略）4A:对照组  4B:非电针组  4C:电针组图6  海马CA3区Bax蛋白表达(IHC×400)（略）4D:对照组  4E:非电针组  4F:电针组表2  三组大鼠海马Bcl-2蛋白表达积分光密度值和阳性神经元细胞数比较（略）*与对照组比较；P<0.05；*与对照组比较P<0.01；#与非电针组比较P<0.01表3

23、0; 三组大鼠海马Bax 蛋白表达积分光密度值和阳性神经元细胞数比较（略）*与对照组比较；P <0.05；*与对照组比较P<0.01；#与非电针组比较P <0.013  讨论海洛因是我国造成机体依赖性的最主要的阿片类药物。海洛因依赖是非常严重的社会问题。海洛因依赖是由于大量摄入外源性阿片类化合物,反馈抑制使内源性阿片肽减少4-5,体内阿片肽系统平衡紊乱,影响一系列神经生理功能。     学习记忆在药物成瘾中居于重要的中心环节,药物成瘾是一种特殊的恶性学习记忆过程6。在被动性回避条件反射模型上所做的研究发现,预先给予阿片类药物可

24、干扰记忆的形成，实验中给药会干扰回忆过程，而训练后给药则干扰记忆的巩固7。报道,长期吸食海洛因可造成智力减退和记忆损害8。海马是调节学习、记忆功能的一个重要脑组织。越来越多的研究表明海马在阿片类依赖产生中有重要作用。大鼠海马形态学的检测表明，在海马结构中，CA1区、CA3区、DG区是三个重要的功能区。本实验选取海马CA1区、CA3区锥体细胞和DG区颗粒细胞作为观察指标以判断海洛因依赖对海马神经细胞凋亡及凋亡调控蛋白表达的影响以及电针的干预作用。     细胞凋亡(apoptosis)一种由基因控制的细胞自主性死亡，是真核细胞受到外来的某种信号的刺激，通过

25、自身的遗传机制，释放内源性DNA内切酶的激动而发生的自动化死亡。研究发现:海洛因成瘾大鼠脑组织广泛出现神经元凋亡,而且是海洛因成瘾造成脑神经元死亡的主要形式9。细胞凋亡在海洛因成瘾机制、损害机制、机制等方面的作用目前研究尚少,但有潜在意义，很值得进一步研究。近年来的研究表明,海洛因成瘾大鼠脑内多部位（前额皮质、伏隔核、海马、中脑腹侧被盖区、下丘脑等部位）神经元胞体、轴突、树突都出现变性、坏死、凋亡等超微病理结构改变,而前额皮质、伏隔核、海马、中脑腹侧被盖区、下丘脑都属于海洛因成瘾脑内“奖赏环路”上的重要环节,研究海洛因成瘾大鼠脑内多部位神经元超微结构的改变,旨在为海洛因致瘾、损害机制的阐明、戒

26、断治疗等提供依据10。     细胞凋亡过程由一系列的基因参与调控，神经细胞凋亡过程中,调控凋亡的基因主要是Bcl-2(B细胞淋巴瘤/白血病2)。Bcl-2基因家族的成员众多，但其主要分两类:抑制凋亡基因，如Bcl-2；促凋亡基因，如Bax。如果Bcl-2蛋白表达过量，它和Bax蛋白结合成异源二聚体(Bcl-2-Bax)后，剩余的Bcl-2蛋白相结合成同源二聚体(Bcl-2-Bcl-2),此时细胞存活；相反，如果Bax蛋白占主导地位，它在结合Bcl-2蛋白后，自身形成同源二聚体(Bax-Bax)，此时导致细胞死亡。    据

27、报道电针能有效控制海洛因依赖戒断反应11,但电针对海洛因依赖神经细胞凋亡及凋亡调控基因表达的影响目前尚未报道。本实验采取电针大鼠百会、大椎穴来检测其对学习记忆行为和皮层及海马神经细胞凋亡的影响。百会、大椎属督脉经穴，督脉又归属于脑，是调节大脑功能的要穴。研究证实,针刺百会可提高人及动物的记忆力12。进一步的研究表明,督脉位于身体的中轴线上,可以通过两侧神经司控的特性,促进脑功能的代偿和重组作用,联合刺激百会、大椎两穴,能减少海马区内神经元损伤而保护神经细胞。本实验图像分析发现，海洛因成瘾非电针组大鼠海马神经细胞凋亡指数(AI)比对照组明显升高,Bcl-2蛋白表达明显降低,Bax蛋白表达明显增高；而电针组细胞凋亡指数(AI)比非电针组明显降低,Bcl-2蛋白表达增高,Bax蛋白表达降低,提示海洛因通过引起Bcl-2蛋白表达下调和Bax蛋白表达上调而促进海马神经细胞凋亡,而电针百会、大椎穴通过上调凋亡抑制基因Bcl-2在蛋白水平上的表达，下调凋亡促进基因Bax在蛋白水平上的表达,抑制海洛因引起的海马神经元细胞凋亡而保护脑细胞。海洛因引起海马神经元细胞凋亡可能是其损害学习记忆的重要机制之一,推测其很可能作为细胞凋亡级