黄芩苷对人牙周膜细胞RANKLOPG表达的影响及其作用机制

1、黄芩苷对人牙周膜细胞RANKLOPG表达的影响及其作用机制         11-01-07 13:52:00     作者：陈悦，吴织芬，杨连甲    编辑：studa20【摘要】  目的 研究黄芩苷对人牙周膜细胞核因子B受体激活物配基和骨保护素(RANKLOPG)表达的影响及其作用机制。方法 首先构建转化生长因子型受体(TGFR)靶向siRNA真核表达载体，转染正常人外周血T细胞，使T细胞表面的TGFR基因沉默，继而将转染

2、与未转染靶向性TGFR基因沉默的T细胞和正常人牙周膜成纤维细胞置于加有黄芩苷和内毒素的培养基中，分为6组：正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞+黄芩苷;正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞;正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞+黄芩苷;正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞;正常牙周膜成纤维细胞+黄芩苷;正常牙周膜成纤维细胞。共培养48h，RTPCR检测牙周膜细胞RANKL和OPG的表达，计算RANKL/OPG比值。结果 酶切鉴定正确的克隆测序结果与设计的目的序列完全一致;转染siRNA1的T细胞组的TGFR mRNA的表达被明显抑制;RANKL/OP

3、G的比值在各组间的差异有统计学意义(P<0.01)。结论 成功构建了TGFR靶向siRNA真核表达载体并成功转染T细胞;黄芩苷可以降低牙周膜细胞表面RANKL/OPG比值;TGF的信号传导在黄芩苷影响牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG表达过程中起着重要作用;黄芩苷并非只通过TGF信号传导通路，而是亦通过其他通路对牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG进行调控。 【关键词】  转化生长因子型受体;小干扰RNA;核因子B受体激活物配基;骨保护素;牙周膜成纤维细胞ABSTRACT: Objective To study the effect of baicalin on th

4、e expression of receptor activator of nuclear factorB ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) in cultured human periodontal ligament cells (HPDL cells) as well as its action mechanism. Methods We first constructed small interferring RNA (siRNA) eukaryotic expression vector targeted transforming gro

5、wth factor receptor (TGFR), and then transfected it into T cells. Then HPDL cells together with T cells transfected with siRNA or not were placed in medium that had been added with lipopolysaccharide (LPS) and baicalin. They were divided into six groups and cultured for 48 hours. Reverse transcripta

6、sepolymerase chain reaction (RTPCR) was used to observe the effect of baicalin on OPGRANKL expression in HPDL cells. Results The clone sequence correctly identified by RTPCR was consistent with the designed target sequence. The recombinant vector was constructed successfully and the expression of TG

7、FR of T cells which had been transfected with siRNA1 was inhibited obviously. Ratio of RANKL/OPG in each group differed significantly (P<0.01). Conclusion siRNA eukaryotic expression vector of recombinant targeting gene TGFR has been constructed and it has been transfected T cells successfully; B

8、aicalin can reduce the ratio of RANKL/OPG on PDL cells; TGF signaling transduction plays an important role in the effect of baicalin on RANKL/OPG ratio on PDL cells; Baicalin acts not only through TGF to regulate RANKL/OPG in PDL cells, but also through other pathways.KEY WORDS: transforming growth

9、factor receptor (TGFR); small interfering RNA(siRNA); receptor activator of nuclear factorB ligand (RANKL); osteoprotegerin (OPG); periodontal ligament cells (PDLC)骨保护素(osteoprotegerin, OPG)及其配体核因子B受体激活物配基(receptor activator of nuclear factorB ligand, RANKL)是调控破骨细胞生成和活化的关键因子，在调节骨质吸收中发挥着重要作用。研究发现OPGR

10、ANKL能在人牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament cell, PDLC)表达，并受多种因素调节13。在口腔局部微环境中,众多因素通过作用于牙周组织，使OPG与RANKL的浓度增加或减少来调控局部骨组织代谢。细菌激发的诉诸免疫炎症反应是造成和影响牙周组织破坏的主要原因。黄芩苷的抗炎作用则决定了其在牙周病的防治中可能起到重要作用。有研究证实，黄芩苷、淫羊霍苷和大黄素组合时可抑制内毒素(LPS)刺激下人牙龈成纤维细胞中前列腺素E2(PGE2)的产生，亦可抑制实验性牙周炎牙槽骨吸收4。本研究的第一个目的，即拟通过观察黄芩苷对PDLC上OPGRANKL表达的影响，从而证实黄芩苷对

11、牙槽骨的吸收的调节作用。牙周炎时，T细胞的数量、活性增高，导致炎症细胞因子分泌增加，加重牙周炎症和骨吸收。转化生长因子(transforming growth factor , TGF)可以抑制T细胞的活性和增殖56。黄芩苷抗炎作用的机制也与抑制白介素1(IL1)、肿瘤坏死因子(TNF)等炎性因子的过度产生有关78，因而设想黄芩苷的抗炎抗骨吸收作用可能是通过TGF实现的。本研究的第二个目的，即黄芩苷是否通过增强TGF对T细胞的抑制作用，引起T细胞活性降低、数量减少，导致T细胞在内毒素作用下分泌TNF等炎症因子减少，继而影响OPGRANKL，降低破骨细胞形成，从而减少骨丢失。为达到以上两个研究目

12、的，本实验首先构建了靶向转化生长因子型受体(transforming growth factor receptor, TGFR)的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)真核表达载体，并将其转染T细胞，随后将正常PDLC与转染或未转染siRNA的T细胞置于加有内毒素和黄芩苷的培养液中，观察黄芩苷对正常PDLC上OPGRANKL表达的影响。1 材料与方法1.1 TGFR靶向siRNA真核表达载体的构建 根据GenBank中报道的TGFR核苷酸序列，参考siRNA的设计原则，按照pSilencer3.1H1载体的设计要求，设计2条siRNA序列。TGFR siRN

13、A转录模板由北京华大公司合成，RNAi TGFR目标序列依次为：5GATCCGCAGCATGTGTATAGCTGAATTCAAGAGATTCAGCTATACACATGCTGCTTTTTTGGAAA3和5GATCCGCCAGCCATTGCTCATAGATTCAAGAGATCTATGAGCAATGGCTGGCTTTTTTGGAAA3，分别命名为siRNA1和siRNA2。两个片段直接与经BamH和Hind酶切的pSilencer3.1H1载体连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5，摇菌培养后提取质粒，送北京华大公司进行序列测定。将测序正确的克隆分别命名为siRNA1和siRNA2。1.2 T细胞的分离

14、培养 取正常健康志愿者外周血5mL于肝素抗凝管中，加入RosetteSep人T细胞富集抗体混合液(50mL/L全血)，充分混匀,室温静置30min，以等倍体积PBS稀释，充分混匀后小心加到淋巴分离液上，以20、2000r/min离心20min，取中间单核细胞层，用PBS液洗两次(4、1500r/min 15min)，然后用RPMI1640完全培养液调整细胞数为2×1094×109/L。1.3 潮霉素筛选浓度的确定 于6孔板中，接种T细胞3.0×105/孔，加含100mL/L FBS的DMEM培养基2mL，分别加入50g/L的潮霉素2、4、6、8、10、12L，潮霉

15、素终末质量浓度依次为50、100、150、200、250、300mg/L，37培养。每3d换液1次。显微镜下观察细胞的生长状况，以第8天能杀死孔内所有T细胞的潮霉素浓度确定为筛选浓度。1.4 脂质体介导的T细胞的稳定转染 转染前24h，在6孔板内按1×106细胞/孔接种细胞，转染方法按试剂说明书进行。3周后将稳定生长的细胞克隆逐次转移至24孔板、6孔板和培养瓶中扩大培养，获得整合有pSilencer3.1H1重组质粒并能稳定表达siRNA1和siRNA2的单克隆细胞株。1.5 细胞生长曲线的绘制 将已转染了siRNA1和siRNA2的单克隆细胞株制备单细胞悬液，接种96孔板，设5个复

16、孔，37、50mL/L CO2条件下培养。设正常人T细胞作为对照组。1、2、3、4、5、6、7d时，弃液，每孔加入20L 5mg/mL的MTT，继续培养4h后弃液，每孔加入150L DMSO，震荡10min溶解结晶，用酶联免疫检测仪测定各孔490nm的吸光度值。以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。1.6 RTPCR检测TGFR的表达 根据人TGFR的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计了扩增TGFR的RTPCR引物P1和P2，以actin作为内参照。引物由上海Sangon公司合成。actin：5CTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3，5 CTCCT

17、TAATGTCACGCACGATTTC 3，520bp，退火温度52;TGFR：5 TTTCCACCTGTGACAACC 3，5 TGACAGATATGGCAACTC 3，346bp，退火温度55。按照TRIZOL说明书提取细胞总RNA。按照RTPCR试剂盒说明书,将mRNA逆转录为cDNA,再将所得的cDNA进行PCR扩增。取5L PCR反应产物，经过15g/L琼脂糖凝胶电泳后,在紫外投射反射仪下观察结果。采用DNA Marker作为DNA长度标志。通过凝胶图像成像分析系统,以目的基因的PCR扩增片段灰度与相应的内参actin扩增片段灰度的比值作为其mRNA表达水平的相对参数。1.7 Wes

18、tern blot检测TGFR的表达 选取一抗为兔抗人TGFR多抗，二抗为生物素化山羊抗兔IgG。严格按照ECL Western blot试剂盒说明书步骤操作。1.8 人牙周膜细胞的分离培养 选取1114岁青少年因正畸而拔除的前磨牙，用PBS液反复冲洗，无菌条件下刮取牙根中1/3的牙周膜组织，剪碎后用2.0×105u/L 型胶原酶37消化1h，800r/min离心5min，弃上清;用无血清DMEM培养液悬浮组织，800r/min离心5min，弃上清;加适量含100mL/L新生牛血清的DMEM培养液，连同组织块转至6孔板，37，950mL/L空气、50mL/L CO2、100%湿度条件

19、下培养。每23d换液1次。取第58代细胞用于实验。免疫组化法检测波形丝蛋白和角蛋白抗体以鉴定细胞来源。1.9 实验分组 将转染与未转染靶向性TGF R基因沉默的T细胞与人牙周膜细胞置于含有1.0g/L的LPS(美国Sigma公司，按说明书配制)和1.0mg/L黄芩苷溶液(中国药品生物制品检定所，精密称取干燥至恒重的黄芩苷标准品5.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，再将其浓度稀释至1.0mg/L)的培养基中，共培养48h。实验分为6组：正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞+黄芩苷;正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞;正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+

20、正常T细胞+黄芩苷;正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞;正常牙周膜成纤维细胞+黄芩苷;正常牙周膜成纤维细胞.1.10 RTPCR检测 用TRIZOL试剂盒提取牙周膜细胞总RNA，取2.5g总RNA用逆转录试剂盒进行转录。OPG分子引物序列：上游引物5TCAAGCAGGAGTGCAATCG3，下游引物5AGAATGCCTCCTCACACAGG3，该引物将产生342bp的cDNA片段。RANKL分子引物序列：上游引物5GGCTCATGGTTAGATCTGGC3，下游引物5TGACCAATACTTGGTGCTTCC3，该引物将产生351bp的cDNA片段。actin分子引物序列：上游引物5CAATTCATGTTTGAGACCTTCAA3，下游引物5CCGGATCCATCTCTTCCTGGAAGTCCA3，该引物将产生362bp的cDNA片段。上述引物序列由由上海Sangon公司合成。取PCR反应产物15L在15g/L琼脂糖凝胶上电泳，置于凝胶电泳成像仪，利用凝胶系统分析软件Bandscan 5.0进行半定量分析。1.11 统计学处理 所有数据