糖尿病肥胖鼠胰岛β细胞3维高分辨影像研究(一)

1、糖尿病肥胖鼠胰岛细胞3维高分辨影像研究(一)    【摘要】 目的：研究患糖尿病肥胖鼠（ob/ob）体内胰岛细胞的黄素蛋白(Fp)、还原型辅酶(NADH)和焦脱镁叶绿酸标记的2-脱氧葡萄糖(Pyro-2DG)的荧光强度分布特点。方法：使用低温成像器(Cyro-imager)检验胰腺胰岛细胞的氧化还原特性，观察胰腺胰岛细胞内Pyro-2DG的累加情况。结果：通过获得的胰腺组织的2维影像图，使用三维可视化(Amira)医学专用软件可构建出3维高分辨影像。结论：这项研究成果有助于评估胰腺组织光学研究的有效性。 【关键词】 焦脱镁叶绿酸标记的2-脱氧葡萄糖；患糖

2、尿病肥胖鼠；胰岛细胞；3维高分辨影像Abstract Objective: To study fluorescence intensity distribution of Fp, NADH and Pyro-2DG in pancreatic islet cells and liver cells of obese-diabetic (ob/ob) mice. Methods: A cryo-imager was used to image the pancreas and liver and to examine the redox characteristics of the pancre

3、atic islet cells and the accumulation of Pyro-2DG in pancreatic islet cells was observed. Results: High-resolution 3D images were constructed through 2D images of the serial sections of pancreas acquired using Amira medical software. Conclusion: This study helps to eva luate the validity of optical

4、studies of pancreatic tissue.Key word Pyropheophorbide 2-dexyglucose (Pyro-2DG); Obese-diabetic mice ; Pancreatic islet cells;High-resolution 3D images糖尿病是一种代谢系统疾病，与胰岛素分泌量少或胰岛素抵抗而引起的高血糖有关。治疗糖尿病的费用十分可观。据世界卫生组织预计，到2025年，全球成人糖尿病患者人数将增至3亿，而中国糖尿病患者人数将达到4 000万，未来50年内糖尿病仍将是中国一个严重的公共卫生问题1。因此，研究一种由功能性胰岛细胞缺乏导

5、致的糖尿病的无损诊断法十分必要。胰岛中包含有细胞、细胞、细胞、PP细胞。胰岛素可以促进机体利用吸收的葡萄糖而产生能量，由于细胞缺损导致胰岛素分泌不足而引起糖尿病。胰胰岛细胞损伤程度与糖尿病病情及转归有直接关系，因此在胰腺组织中应用光学成像技术研究胰岛细胞缺损程度前景十分乐观。在研究中，使用同型结合突变型患糖尿病肥胖鼠(ob/ob)作为实验动物。该鼠具有肥胖和胰岛肥大的特点，可引起抗胰岛素性、代谢减退、低体温和胰岛素过剩等问题。此外，该鼠可以在低葡萄糖浓度的状态下分泌出高于正常量4倍的胰岛素。1 材料与方法1.1 仪器 低温成像器（Cryo-imager）可以对冷冻截留组织进行荧光强度成像。低温

6、成像器包括液氮样本仓、铣刀头和具有步进电动机驱动光导的光扫描器（汞灯、激光二极管、冷光镜、光电倍增管、过滤器等）。黄素蛋白(Fp)发散光波长440nm、吸收光波长525nm，NADH发散光波长365nm、吸收光波长460nm，焦脱镁叶绿酸标记的2-脱氧葡萄糖（Pyro-2DG）发散光波长405nm、吸收光波长670nm。由计算机控制的扫描分辨率为128×128像素，光导的步长为80m，每16毫秒采集1个像素，1个像素平均4个采样点。1.2 动物样本的准备和低温成像器荧光成像 10只9周龄同型结合突变型患糖尿病肥胖鼠(ob/ob)随机分为实验组5只和对照组5只，将两组动物全部麻醉，实验

7、组(ob/ob)鼠经尾部静脉注射0.05mg Pyro-2DG，对照组(ob/ob)鼠没有接受Pyro-2DG注射。麻醉2个小时后，在液态氮冷冻甲基乙烷中将胰腺冷冻截留，制作成实验用样品。样本在液氮样本仓中打磨后进行扫描，扫描自上而下进行。每一次，都在掠过样本100m之下的相同位置开始扫描。连续断面经过一系列的扫描后，可获得FP、NADH、Pyro-2DG荧光强度数据。2 结果与讨论检测胰腺细胞中葡萄糖的代谢是识别细胞的有效方法，因为葡萄糖诱使胰岛素分泌与胰岛细胞的代谢情况有关。在葡萄糖进入细胞后被氧化供能，随后代谢物增加，这些均可通过NADH/(Fp+NADH)氧化还原率指数进行监测。近些年

8、来，在成像中使用了荧光葡萄糖诱导剂。Zheng等2合成一种与近红外(NIR)荧光葡萄糖相似的Pyro-2DG，这种Pyro-2DG可在快速代谢组织中抑制和聚积。2.1 由胰岛摄入的Pyro-2DG特性及氧化还原状态 实验组老鼠胰腺内的Pyro-2DG信号很强，而对照组老鼠胰腺内则没有显示Pyro-2DG信号，这说明胰腺可吸收大量葡萄糖，见图1。这是因为当体内面临较高血糖浓度时，胰岛就会吸收更多的葡萄糖，以产生更多的能量合成能够降低血糖的胰岛素。因此，许多不可代谢的荧光葡萄糖Pyro-2DG-6-P在胰岛内潴留。图1 胰腺NADH、Pyro-2DG、氧化还原率指数影像图A 实验组，B 对照组2.

9、2 实验组NADH和Pyro-2DG的多层影像 使用Mat Lab程序，实验组动物胰腺的NADH和Pyro-2DG的多层影像可以通过连续的2维影像获得，幻灯片中所显示的实验组老鼠胰腺的全部Pyro-2DG信号分布均匀与NADH信号相似，这显示了能量代谢活跃区域。见图2。图2 实验组胰腺NADH和Pyro-2DG的多层影像2.3 实验组的NADH和Pyro-2DG的3维影像 实验组NADH和Pyro-2DG的3维影像可通过使用Amira软件从2维影像中获得。见图3。图3 实验组胰腺Fp、NADH和Pyro-2DG的3维影像 以上图形清晰地表明，胰腺组织胰岛细胞可以吸收Pyro-2DG，用低温成像

10、器成像后可获取高清晰度3维图像。此项研究可用来评估胰腺组织光学研究的有效性，以此判断细胞的缺损程度，Pyro-2DG的荧光强度能够显示胰腺细胞的氧化还原代谢状态。这一点对于胰岛细胞的功能成像很重要，对继续研究肥胖糖尿病鼠胰岛细胞的剂量效应有指导作用。【参考文献】1 李永强, 冯志强， 宋宏锐，等.葡萄糖激酶及其小分子活化剂研究进展J.药学学报,2006,41(5):390-393.2 Zhang M,Zhang Z,Blessington D,et al. Pyropheophorbide 2-Deoxyglucosamide: A New Photosensitizer Targeting at Glucose TransportersJ.Bioconjugate Chem，2003,14:709-714.3 Patterson GH,Knobel SM,Arkhammar P,et al.Separation of the glucose-stimulated cytoplasmic and mitochondrial NAD(P)H responses in pa