表达白细胞介素10的系膜细胞基因转移载体的建立

1、    表达白细胞介素10的系膜细胞基因转移载体的建立        【摘要】目的为特异性地将病毒性白细胞介素10(vIL-10)基因转移到肾脏提供一种手段。方法应用逆转录病毒载体介导的基因转移技术将外源性基因vIL-10转移到大鼠肾脏系膜细胞，应用RT-PCR、ELISA方法检测其表达，并通过对混合淋巴细胞反应(MLR)的影响对其活性进行分析。结果vIL-10在转染的系膜细胞表达20 000 pg.(106细胞)-1/24h，应用3 H-TdR掺入法检测vIL-10对MLR

2、的影响，实验组明显低于对照组(P0.05)。结论外源性基因在系膜细胞有效地转录和表达，并对MLR有抑制作用。【关键词】白细胞介素10系膜细胞基因转移 Establishment of mesangial cell gene transfer vector expressing interleukin-10JI Yunian,YANG Yanqiang,CHEN Yongxiong,et al.Department of Nephrology,First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzho

3、u 510080.【Abstract】ObjectiveTo provide a method for specificity transfer vIL-10 gene to kidney.MethodsvIL-10 gene was tranferred into rat glomerular mesangial cells by retroviral-mediated gene transfer techniques.The expression of vIL-10 was detected by RT-PCR，ELISA and its bioactivity was determine

4、d by mix lymphocyte reaction (MLR).ResultsThe amount of expression of vIL-10 in mesangial cell at least was 20 000 pg.(106 cell)-1/24h，and the 3 H-thymidine incorporation in MLR was significantly lower than that in control group (P0.05).ConclusionvIL-10 gene can be expressed effectively in mesangial

5、 vector,and can inhibit the MLR.【Key words】Interleukin-10Mesangial cellGene transfer成功的肾脏移植给许多终末期肾病的患者带来了福音，但是，由于供受体主要组织相容性抗原复合物(MHC)的差异，导致免疫排斥。虽然环孢素A(CsA)等药物的应用极大地促进了器官移植的发展，但由于全身性地应用免疫抑制剂易导致机体感染、肿瘤的发生及本身的毒性作用从而严重地影响着移植受者的存活。因此，不少研究者希望能将免疫调节物质特异性地转移到移植物，使其在移植物局部发挥作用，从而将避免全身应用免疫抑制剂的毒副作用。通过建立系膜细胞基因转移

6、载体，将免疫调节物质(如vIL-10)基因转移到移植肾为这种设想提供了实现的可能和希望。利用系膜细胞载体将免疫调节基因特异地转移到肾小球1，使其在局部发挥免疫抑制从而对抗受体的免疫排斥作用，从而避免了全身性应用免疫抑制剂的毒副作用。为了将vIL-10特异性地转移到肾脏，我们通过逆转录病毒载体介导的基因转移方法将vIL-10基因转移到大鼠系膜细胞(MsC)，建立了携带免疫抑制基因的系膜细胞载体，为进一步探索IL-10在诱导免疫耐受中的作用及应用IL-10进行免疫基因治疗提供了物质基础。材料与方法一、材料含vIL-10cDNA的逆转录病毒重组体pLvSN(构建参见文献2)，双嗜性包装细胞PA317

7、(中山医科大学免疫学教研室)，NIH3T3(暨南大学分子医学中心)。总RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒及PCR试剂盒(Promega)。脂质体(lipofectin AMINE),DMEM/F12培养基，胎牛血清及G418(Gibco BRL)。RT-PCR引物53ATGGAGCGAAGGTTAGTGTC，35ACTCTTGTTCTCACGGCAG(上海细胞生物学研究所合成)。polybrene(Sigma)。vIL-10单克隆抗体JES3-9D7，JES3-B11(Pharminge)。3 H-TdR(中国原子能研究所)。近交系小鼠BALB/C、CH57L/6，近交系Lewis大鼠(中山医科大

8、学实验动物部)。二、方法(一)包装细胞系的传染：1.包装细胞PA317的转染与克隆筛选：用脂质体法转染包装细胞PA317，按脂质体试剂盒说明书方法进行。2.测定逆转录病毒载体效价：经反复3代感染的抗G418的PA317阳性克隆以1×105接种于100 mm2的培养皿，以不含G418的完全培养基培养24小时后换以新鲜培养基收集上清。取每个克隆的培养上清1ml(含病毒颗粒)，分别以103，104，105的倍数作系列稀释，取上述系列稀释的培养液上清1ml，加入到1×105NIH3T3的6 cm2的培养皿中，同时加入polybrene使其终浓度为6 mg/L,37孵育3小时后加入G

9、418(500 mg/L)选择培养基培养2周，计数G418抗性克隆，病毒滴度克隆数×稀释倍数×10(CFU/ml)。(二)大鼠肾系膜细胞转染：1.大鼠肾系膜细胞的培养和鉴定：按文献3方法，无菌条件下取68周Lewis大鼠肾皮质，置80目网筛上研磨，收集网下肾小球，置200目筛网上用Hank液冲洗并收集肾小球，以质量分数为15%的新生牛血清(NBS)-DMEM/F12培养液悬浮肾小球，置37体积分数为5% CO2孵箱培养，待瓶长满后用质量分数为0.25%胰蛋白酶加质量分数为0.02%EDTA消化传代。2.大鼠肾系膜细胞的转染：经传4代的系膜细胞以5×105细胞传至6

10、孔培养板，加入无G418培养的PApLvSN培养24小时的上清1ml，加入polybrene使其终浓度为6 mg/L，48小时后换为含G418(800 mg/L)培养基筛选培养。(三)vIL-10在系膜细胞表达的检测：1.RT-PCR检测vIL-10mRNA的表达：用RNA提取试剂盒异硫氰酸胍一步法提取系膜细胞总RNA。随机引物法逆转录为cDNA，以vIL-10特异性引物进行扩增。97变性5分钟；9660s，60 90s，72 C120s，30个循环。取5 l PCR产物在质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳，检测vIL-10 mRNA在MsC的表达。2.ELISA检测vIL-10的表达：取经G41

11、8筛选的系膜细胞(1×106)培养24小时上清，按ELISA试剂盒操作说明进行，其中JES3-9D7作为包被抗体，JES3-B11作为检测抗体。3.vIL-10生物活性分析：即用vIL-10对体外淋巴细胞混合培养(MLC)的抑制效应。取近交系小鼠BABL/C和CH57BL/6的脾细胞应用淋巴细胞分离液分别制成单个核细胞悬液。以BABL/C脾细胞作为刺激细胞，CH57BL/6脾细胞作为效应细胞。脾细胞经密度梯度离心，PBS洗涤2次，Tris-NH4Cl溶解RBC，RPMI 1640培养基+质量分数为10% FCS以5×105的效应细胞及经40 g/L丝裂霉素处理的刺激细胞混合

12、培养，实验组每孔加入不同比例稀释的pLvSN转染的MsC的上清，对照组每孔加入相同比例稀释的空载体pLXSN转染的MsC上清。96孔板37体积分数为5%的CO2培养箱培养6天。所有实验均设4个复孔重复3次，应用3 H-TdR法检测淋巴细胞的增殖状态，在最后培养结束前6小时每孔加入1Ci的3 H-TdR，收集细胞，以液闪仪测定cpm以了解效应淋巴细胞的增殖情况。结果一、逆转录病毒载体转染包装细胞PA317和假病毒颗粒滴度测定1.用lipofectin AMINE将pLXSNvIL-10重组质粒导入对数增长期的双嗜性包装细胞PA317，在G418(300 mg/L)选择培养34天后部分细胞开始死亡

13、，7天后大量PA317细胞被杀死，仅见散在的单个抗性G418细胞，23周后单个细胞逐渐形成克隆。2.G418抗性克隆在高浓度G418选择培养基中扩增筛选，使那些没有获得重组表达质粒的包装细胞，或只是短暂表达外源性基因的包装细胞在高浓度的G418培养基中被杀死，从而获得转入了重组质粒并持续表达包装的细胞，因这些细胞获得neoR(G418抗性基因)而能在高浓度的G418培养基中生长。为增加假病毒滴度，在第一代产假病毒的PA317细胞经筛选培养扩增后，换为不含G418的培养基的培养上清感染新的PA317细胞，获得第二代产假病毒的包装细胞系，同样方法获得第三代产假病毒的包装细胞系。3.收集反复三代感染

14、的PA317细胞上清感染NIH3T3细胞，以含G418的培养基选择培养2周后根据G418抗性克隆形成数计算病毒滴度为1×107。二、vIL-10在系膜细胞表达的分析1.RT-PCR产物电泳分析：以vIL-10特异性引物进行扩增，未经感染的MsC作为阴性对照，PCR产物在质量分数为1.0%琼脂糖凝胶(1×TAE)电泳，结果感染外源性基因的MsC细胞扩增出特异性387bp的片断，而未感染的MsC则未扩增出相应的片段，说明vIL-10mRNA在转染的MsC的表达。2.ELISA检测系膜细胞产生vIL-10：重组假病毒上清感染的系膜细胞，经培养24小时的上清vIL-10的表达20

15、000 pg/106细胞，而空载体感染的系膜细胞及对照系膜细胞均未检测到vIL-10的表达。3.vIL-10对MLR的影响：含vIL-10的转化的系膜细胞的培养上清对MLR的影响(3 H-TdR法)，在MsC/pvIL-10组随着培养上清vIL-10浓度的增加，出现对MLR明显的抑制作用，而对照组MsC/pLXSN却对MLR无影响，P0.05。通过vIL-10对MLR的抑制效应初步证实了vIL-10抑制免疫应答的生物学作用。讨论器官移植面临的免疫排异问题是影响移植物存活的主要障碍，全身性的免疫抑制剂的应用产生诸如感染、肿瘤等毒副作用而严重地影响着患者的存活。应用局部免疫抑制治疗将可能避免全身应

16、用免疫抑制剂所带来的毒副作用。一些细胞因子(如IL-10)通过抑制巨噬细胞抗原提呈及T细胞激活、增殖等环节抑制宿主对移植抗原的免疫应答，对于抑制机体的免疫排斥，诱导受体对供体的免疫耐受具有重要意义4。使用基因工程修饰的肾小球系膜细胞作为基因转移的载体，是一个靶向性肾小球的新的基因转移系统1。从分离的肾小球建立肾小球系膜细胞载体，在体外经基因工程处理，使其表达外源基因产物(vIL-10)，然后通过肾循环输回体内。因培养大鼠系膜细胞直径在1525 m，而大鼠肾小球毛细血管直径在525 m注射到肾循环的系膜细胞被滞留在肾小球毛细血管，一些细胞可通过迁移转移到系膜区。这些被定位到肾小球的系膜细胞在体内

17、持续表达外源性蛋白质并通过肾小球毛细血管绊、毛细血管内皮窗及系膜细胞途径扩散到整个肾小球，从而其介导的免疫抑制物质在肾小球局部持续并发挥免疫抑制作用但不影响全身的免疫系统。这些特点优于直接使用病毒载体或脂质体介导的基因转移。将vIL-10转移到系膜细胞一个较好的方法是通过逆转录病毒载体。逆转录病毒介导的基因转移是将外源性基因导入靶细胞的有效手段，它不但能高效地将外源基因转入靶细胞，而且能将外源基因有效地整合到宿主细胞基因组中，并随细胞分裂而传给子代，在基因治疗中得到广泛的应用。我们应用的逆转录病毒载体来源于Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)，是LN载体的一种，是Miller等在逆转录病

18、毒载体N2基础上构建的新一代载体5。在结构上属VIP(vectors with internal promotor，带有内部起动子的载体)，不仅去除了gag,pol,env等结构基因，而且将gag基因的翻译起始密码子ATG变成终止子TAG，将5端MoMLV序列用相应的小鼠肉瘤病毒(MoMSV)序列所取代，进一步减少了同源重组的概率，使逆转录病毒载体介导的基因转移隐患大大降低，具有较高的安全性。经转染包装细胞PA317后获得较高的病毒滴度，是其他逆转录病毒载体的1015倍6。Kaleka等7利用pLXSN载体已成功地对ADA，凝血因子等进行了基因转移及表达的研究。本研究构建的逆转录病毒重组体载体

19、带有EB病毒开放读码区BCRF1基因，编码vIL-10，受控于上游5LTR，5LTR内含有启动子及增强子，调控vIL-10的转录和表达。然后通过逆转录病毒载体将vIL-10转移至系膜细胞，我们通过RT-PCR及ELISA方法检测到vIL-10的表达，最终表明建立了携带vIL-10系膜细胞基因转移载体。vIL-10是EB病毒(EBV)基因组中一段开放读码区BCRF1编码，与鼠和人的IL-10具有高度的同源性的蛋白质。IL-10被称为细胞因子合成抑制因子(CSIF)，对机体的许多免疫应答产生负调节作用，并在许多长期存活的移植物观察到IL-10的表达增加8。vIL-10和IL-10具有许多相同的生物

20、活性，如抑制Th1细胞IFN-等的表达，下调单核细胞-巨噬细胞MHC 类抗原及其共同刺激信号B7 9、粘附分子(ICAM-1)的表达10。vIL-10抑制Th1细胞的激活及降低巨噬细胞抗原提呈功能及其辅助作用，在器官移植中可减少抗原特异性T淋巴细胞的产生，对临床器官移植抗免疫排斥有重要作用。因此，如果将vIL-10作为局部免疫抑制剂转移到移植物，将可能在局部发挥免疫抑制作用而抑制受体对移植物的免疫应答，对延长移植物存活有重要意义。我们通过MLR探讨了vIL-10的生物学功能，表明vIL-10对同种异体抗原免疫应答的免疫抑制作用。因此，对于抑制由于移植物抗原诱发的免疫应答具有重要意义。建立携带v

21、IL-10系膜细胞基因转移载体，为进一步研究以系膜细胞为载体的基因治疗转移体系，将vIL-10特异地转移到移植肾的作用，及研究IL-10在延长移植物存活中的作用，避免全身应用免疫抑制剂所产生的毒副作用将有重要的意义。我们的研究是基因治疗技术应用于肾脏移植的初步探索。本课题受广东省科委博士点启动基金和中山医科大学校重点基金资助作者单位：510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾内科参考文献1杨彦强，张仕光.基因转移的策略和途径.国外医学免疫学分册，1997，17(增刊)：38-41.2杨彦强，陈永雄，张仕光，等.vIL-10逆转录病毒载体的构建及在鼠成纤维细胞的表达.中山医科大学学报，199

22、8，1：31-34.3陈永雄，王丹，叶任高，等.DNA抗DNA复合物促进肾小球系膜细胞产生白介素6.中华肾脏病杂志，1994，10：204-206.4Moore KW,Vieira P,Fiorention DF,et al.Homology fo cytokine inhibitory factor IL-10 to Epstin-Barr virus gene BCRF1.Science,1990,248(4960):1230-1234.5Miller AD,Resman GJ.Improved retroviral vectors for gene transfer and expression.Biotechniques,1989,7:980-989.6Dones O,Mulligen RC.Safe and efficient generation of recombinant retrovirus with amphotropic and ecotropic host ranges. Proc Natal Acad USA,1988,85:6360-6370.7Kaleko M,Garcia JV,Osbrone ERA,et al.Expression of human adenosinedeminase in mice