西地那非同系物逆转人乳腺癌MCF_7_ADR细胞的耐药性研究

1、论著(基础研究西地那非同系物逆转人乳腺癌MCF-7/AD细胞的耐药性研究季恒,葛如意,王德全,梅文杰,黄海波,周俊立,郑士杰,石永超,汪保国,陈思东摘要目的肿瘤多药耐药(multidrug resistance ,MD是肿瘤化疗失败和患者死亡的一个主要原因,研发无毒的MD逆转剂是治愈肿瘤的一项探索性研究。文中探讨2种西地那非同系物对人乳腺癌MCF-7/AD细胞耐药性的逆转作用。方法采用MTT 法检测西地那非、西地那非同系物、多柔比星以及西地那非同系物与多柔比星联合作用对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/AD和敏感株MCF-7的抑制率及IC 50值;运用流式细胞术观察分别经西地那非同系物处理前后,人乳

2、腺癌MCF-7/AD细胞内hodamine 123浓度的改变情况,并分析该2种同系物对乳腺癌细胞P-gp 蛋白外排功能的影响。结果MTT 结果显示10mol /L 的2种西地那非同系物对MCF-7/AD细胞耐药性的逆转倍数分别是636和558;20mol /L 的2种西地那非同系物对MCF-7/AD细胞耐药性的逆转倍数分别是1183和1347;流式细胞术结果显示经10、20mol /L 的西地那非同系物处理后的MCF-7/AD细胞内hodamine 123浓度明显增强。结论一定浓度的西地那非同系物可抑制乳腺癌MCF-7/AD细胞P-gp 蛋的外排功能,并显著逆转其对多柔比星的耐药作用。关键词X

3、DNF1-0425;XDNF8-0113;多药耐药;逆转;乳腺癌细胞中图分类号9799文献标志码A 文章编号1008-8199(201403-0245-05基金项目:广州市国际区域科技合作项目(2011J5200017作者单位:510006广州,广东药学院研究生院季恒(医学硕士研究生;510310广州,广东药学院公共卫生学院(葛如意、王德全、梅文杰、黄海波、周俊立、郑士杰、石永超、汪保国、陈思东通讯作者:汪保国,E mail :gdwangbaoguo163com Sildenafil homologues reverse the drug resistance of human breast

4、 cancer cell line MCF-7/ADJI Heng 1,GE u-yi 2,WANG De-quan 2,MEI Wen-jie 2,HUANG Hai-bo 2,ZHOU Jun-li 2,ZHENG Shi-jie 2,SHI Yong-chao 2,WANG Bao-guo 2,CHEN Si-dong 2(1Guangdong Pharmaceutical University ,graduate school ,Guangzhou 510006,Guangdong ,China ;2GuangdongPharmaceutical University ,School

5、of Public Health ,Guangzhou 510310,Guangdong ,China Abstract Objective Multidrug resistance (MDof carcinoma is an important cause of chemotherapy failure and mortality in cancer patientsThe aim of this study was to explore the reversal effect of XDNF1-0425and XDNF8-0113on Doxorubicin (DOX resistance

6、 in human breast cancer cell line MCF-7/ADin vitroMethods Using MTT assay ,we determined the inhibitory effect ofsildenafil ,XDNF1-0425,XDNF8-0113,DOX and DOX +sildenafil homologues on the growth of human breast cancer cell lines MCF-7and MCF-7/AD,and figured out the inhibitive concentration 50(IC 5

7、0We used flow cytometry to detect the concentration of rhoda-mine123in the MCF-7/ADcells treated with XDNF1-0425or XDNF8-0113and analyzed its effect on P-gp-mediated drug effluxesults The sensitivity of MCF-7/ADto DOX was significantly increased by the two sildenafil homologues XDNF1-0425andXDNF1-01

8、13in a dose-dependent manner (P 005XDNF1-0425and XDNF1-0113reversed the drug resistance of MCF-7/ADby 636and 558times at 10mol /L and by 1183and 1347times at 20mol /L ,respectivelyFlow cytometry showed significantly increased concentrations of rhodamine123in the MCF-7/ADcells after treated with the

9、two sildenafil homologues at 10or 20mol /LConclusion Sildenafil homologues at a certain concentration can inhibit P-gp-mediated drug efflux of the human breast cancer cell lineMCF-7/ADand effectively reverse its resistance to DoxorubicinKey words XDNF1-0425;XDNF8-0113;Mutidrug resistance ;everse ;Br

10、east cancer引言多药耐药(multidrug resistance ,MD是指肿瘤细胞长期接触某一化疗物后可产生对此种化疗药物耐药性,而且可对其他结构和作用机制不同的多种化疗药物产生交叉耐药性。多柔比星(Doxorubicin 是乳腺癌化疗的常用药物,乳腺癌细胞的对多柔比星产生耐药是多柔比星化疗失败的主要原因1,也是影响临床肿瘤患者预后的重要因素2。乳腺癌是排名第一的女性常见恶性肿瘤,寻找克服乳腺癌MD的药物或方法成为当前肿瘤研究的热点3。目前研究发现MD的有效抑制剂有维拉帕米、环孢素A、三苯氧胺、类固醇激素46等,但这些耐药逆转剂干扰传统的抗癌药物药代动力学,且由于可引起严重的毒副

11、作用等,至今都未取得预期的临床效果,因此在临床上被限制使用。寻找低毒高效且与合用的抗肿瘤药物无药动学交互作用的抑制剂,以提高药物的利用度,避免和降低药物的不良反应在指导临床抗肿瘤个体化治疗方面具有重要意义,同时也是当前肿瘤耐药性研究中的重要发展方向。西地那非(Sildenafil,又译昔多芬,是一种研发治疗心血管疾病药物时意外发现的治疗男性勃起功能障碍药物。已有研究发现5型磷酸二酯酶抑制剂西地那非7和伐地那非8能逆转P-gp蛋白介导的MD。同时也有研究发现西地那非和伐地那非可逆转MD相关蛋白7(MP7介导的紫杉醇耐药9。本研究所用药物是西地那非的同系物,由本实验室指导广东药学院药科学院实验室合

12、成的新型化合物,拥有独立的知识产权。本研究旨在通过观察药物处理后MCF-7/AD和MCF-7细胞株的生长抑制率、hodamine123浓度,探讨西地那非同系物体外实验的安全性极其逆转乳腺癌MCF-7/AD细胞耐药性的机制。1材料与方法11细胞株实验所用MCF-7和MCF-7/AD细胞株由中山大学附属肿瘤医院惠赠;其中MCF-7/ AD细胞株是通过浓度递增的多柔比星反复间歇诱导获得,对多柔比星耐药,而MCF-7细胞则为敏感细胞株。12药物和器材本研究所用药物是由广东药学院药科学院实验室合成的新型化合物,化学物结构式见图1(自编号XDNF1-0425和XDNF8-0113,其电喷雾质谱(ESI-M

13、s分别为m/z4123(M+H+和m/z3313(M+H+;西地那非单体由圣约翰大学陈哲生教授惠赠;多柔比星、MTT、hodam-inel23均购于美国Sigma公司,DMEM培养基购于美国Hyclone公司,倒置显微镜为日本Nikon公司产品,流式细胞仪为美国BD公司产品。13细胞培养人乳腺癌细胞MCF-7和MCF-7/ AD于含10%胎牛血清和青霉素(100U/mL、链霉素(100U/mL的DMEM培养液中常规培养(37、5%CO2。实验前在无药培养基中培养2周。细胞隔日换1次培养液,每隔3、4天传代1次 。a:XDNF1-0425;b:XDNF8-0113;c:西地那非图1XDNF1-0

14、425、XDNF8-0113和西地那非结构图Figure1Structural formulas of XDNF1-0425,XDNF8-0113and sildenafil14MTT法检测细胞毒性实验141MTT法10测定2种西地那非同系物体外实验的安全浓度取对数生长期MCF-7和MCF-7/ AD细胞进行种板(8000细胞/孔,CO2的培养箱培养24h后分别加入不同浓度的XDNF1-0425和XDNF8-0113(1、10、100、1000mol/L,不加药物的为阴性对照组,只加培养基的为调零组,每组设3个复孔;继续培养68h后加入10L MTT(5mg/mL,培养4h后酶标仪(波长570

15、nm检测吸光值(A,并绘制药物浓度与细胞生存率曲线图。细胞生存率=A加药组/A对照组100%142MTT法测定2种西地那非同系物对MCF-7/ AD耐药的逆转作用采用上述方法将准备好的MCF-7和MCF-7/AD细胞分组种板,每组设3个复孔。24h后加药,共分5组:只加培养基的调零组;不加药物只加细胞的阴性对照组;多柔比星组:按浓度梯度分别加入多柔比星(001、003、01、03、10、30、100、300mol/L,每孔10L;多柔比星+药物组:XDNF1-0425和XDNF8-0113分别以无毒剂量(25、50、100、200mol/L与多柔比星共同加入;多柔比星+西地那非组:不同浓度的西

16、地那非(25、50、100、200mol/L与多柔比星共同加入。CO2的培养箱继续培养68h后常规MTT比色法测定和记录各孔A值,并计算抑制率、半抑制率(IC50以及逆转倍数。IC50通过线性回归分析计算,细胞抑制率和逆转倍数公式计算如下:细胞抑制率(%=(1实验孔A值/对照孔A值100%逆转倍数=耐药细胞IC50/药物干预下IC50 15细胞内hodamine123累积实验取对数生长期MCF-7和MCF-7/AD细胞种于6孔板加入不同浓度XDNF1-0425和XDNF8-0113(100、200mol/L,CO2的培养箱孵育24h后收获。用胰酶制成细胞悬液并分组装致8个离心管:调零组(只加细

17、胞悬液;阴性对照组(细胞中只加入含有10 mg/mL的hl23;XDNF1-0425(10mol/L+hodamine123组;XDNF1-0425(20mol/L+hodamine123组;XDNF8-0113(10mol /L +hodamine123组;XDNF8-0113(20mol /L +hodamine123组;西地那非(10mol /L +hoda-mine123组;西地那非(20mol /L +hoda-mine123组;各组细胞在37条件下振荡温育60min ,离心后预冷PBS 洗涤细胞2遍,流式细胞仪测定细胞内平均荧光强度(mean fluorescence intens

18、ity ,Ex 488nm ,Em 530nm ,检测药物对细胞内hodamine 123含量的影响。16统计学分析采用SPSS 130软件进行统计分析,定量数据以均数标准差(x s 表示,多组均数比较用单因素方差分析,两两组间多重比较用LSD 检验,仅对两组均数的比较用Student 's t 检验,以P 005为差异有统计学意义。2结果212种西地那非同系物的安全浓度测定XDNF1-0425和XDNF8-0113对细胞株MCF-7和MCF-7/AD的细胞毒性作用,结果见图2。XDNF1-0425和XDNF8-0113对细胞株的IC 50均100mol /L ,在20mol /L 浓

19、度时细胞存活率均90%,因此后续实验选用25、5、10和20mol /L 4个浓度的XDNF1-0425和XDNF8-0113对人乳腺癌MCF-7/AD细胞耐药性的逆转作用。 图2XDNF1-0425和XDNF8-0113对细胞株MCF-7和MCF-7/AD的生长抑制作用Figure 2Inhibitory effects of DNF1-0425and XDNF8-0113at different concentrations on MCF-7andMCF-7/ADcells22XDNF1-0425和XDNF8-0113对MCF-7/AD耐药的逆转作用MTT 结果显示在单独加入多柔比星的对照

20、组中MCF-7和MCF-7/AD2种细胞株的IC 50分别为(015008mol /L 和(1763173mol /L ,可见MCF-7/AD细胞对多柔比星耐药(耐药倍数为1175;XDNF1-0425各浓度组干预后多柔比星对MCF-7/AD细胞的IC 50分别下降至(1305056、(780157、(277077、(149069mol /L ,多柔比星对MCF-7/AD细胞的IC 50在多柔比星+XDNF1-0425各浓度组较多柔比星组明显下降,有统计学意义(P 005或P 001,逆转倍数为分别为135、226、636和1183倍,见表1。但多柔比星对MCF-7细胞的IC 50与XDNF1

21、-0425的加入与否其差异无统计学意义(P 005;XDNF8-0113各浓度组干预后所得的IC 50值与单用多柔比星组比较有明显下降,差异有统计学意义(P 005或P 001,逆转倍数为分别为104、209、558、1347倍,见表1。研究表明XDNF1-0425和XDNF8-0113能有效逆转MCF-7/ADM 细胞对多柔比星的耐药性,且在一定浓度范围内XDNF1-0425和XDNF8-0113的浓度与逆转效果成正比。作为对照组单用西地那非与多柔比星处理后逆转倍数为分别为372、826、1544、2483倍。表1XDNF1-0425和XDNF8-0113逆转MCF-7/AD细胞对多柔比星的

22、耐药性(x s ,mol /L Table 1Effects of sildenafil homologues on the sensitivity of MCF-7and MCF-7/ADcells to Doxorubicin (x s ,mol /L 组别IC 50MCF-7/AD逆转倍数多柔比星组1763173100多柔比星+西地那非组25mol /L 474104*37250mol /L 213097*826100mol /L 114077*1544200mol /L071069*2483多柔比星+XDNF1-0425组25mol /L1305056*13550mol /L 7801

23、57*226100mol /L 277077*636200mol /L149069*1183多柔比星+XDNF8-0113组25mol /L1648086*10450mol /L 824123*209100mol /L 309091*558200mol /L128044*1347与多柔比星组比较,*P 005、*P 00123细胞内hodamine123累积实验hodamine123是一种特异性的P-gp 蛋白荧光底物,通过细胞内hodamine 123的蓄积来反映药物抑制P-gp 蛋白活性的效率,表现为测得的细胞内荧光强度。经10和20mol /L XDNF1-0425和XDNF8-0113

24、处理后的MCF-7/AD细胞,hodamine l23荧光波峰右移,见图3,且在一定浓度范围内XDNF1-0425、XDNF8-0113和西地那非能够抑制MCF-7/AD细胞内hodamine123的外排,见表2;提示XDNF1-0425和XDNF8-0113可抑制MCF-7/AD细胞P-gp 蛋白的外排功能,增加hodamine 123在细胞内的蓄积。 a:调零组;b:阴性对照组;c:100mol/L XDNF1-0425处理组;d:200mol/L XDNF1-0425处理组;e:100mol/L XDNF8-0113处理组;f:200mol/LXDNF8-0113处理组;g:100mol

25、/L西地那非处理组;h:200mol/L西地那非处理组图3流式细胞术检测细胞内hodamine123荧光强度Figure3hodamine123retention analyzed by FCM表2MCF-7/ADM细胞中不同浓度西地那非及其同系物对hodamine123外排的抑制作用(xsTable2Inhibitory effects sildenafil and its homologues on rhodamine123efflux in MCF-7/ADM cells(xs组别平均荧光强度(n=3外排抑制率(%阴性对照组214015XDNF1-0425组100mol/L2530091

26、835231*200mol/L2740172783143* XDNF8-0113组100mol/L2490241667057*200mol/L2770092948193*西地那非组100mol/L2570352021094*200mol/L2970153857286*外排抑制率=(经药物处理的荧光强度阴性对照组的荧光强度/阴性对照组的荧光强度100%与阴性对照组比较,*P005,*P0013讨论MD是目前影响肿瘤患者化疗成功的一个主要因素,随着对MD现象及其机制的不断深入研究,发现MD的产生不是由单一因素引起的,而是多种机制共同参与作用的结果,包括肿瘤细胞凋亡逃避、DNA损伤后修复能力增强、抗

27、癌药物作用分子靶点发生改变、抗癌药物代谢酶活性增强11、药物摄取降低以及进入内药物被主动转运到细胞外12等。近年来,关于天然提取物对肿瘤细胞MD的研究成为热点,国外有学者使用米非司酮(Mife-pristone对卵巢癌耐药细胞株进行体外细胞毒性试验,结果发现5mol/L的米非司酮对细胞生长无影响,但使用该剂量的米非司酮能成功逆转该细胞对多种抗癌药的耐药性13。本次实验经过预实验发现100mol/L和200mol/L浓度的西地那非同系物的逆转效果较好。Elizabeth和Alica14在米非司酮对耐多柔比星人乳腺癌细胞MCF-7/AD体内外耐药逆转作用中试验中测得MCF-7/AD细胞的耐药倍数为

28、41倍。本实验中MCF-7/AD细胞的耐药倍数为1175倍,说明不同实验当中建立的耐药细胞体系存在较大差异,可能是由于原代细胞株对化疗药的敏感性不同和所用药物抗癌效力不同导致。本实验中XDNF1-0425在100mol/L和200mol/L时与多柔比星合用时MCF-7/AD的逆转倍数分别为636和1183倍;而XDNF8-0113在100mol/L和200mol/L时与多柔比星合用时对MCF-7/AD的逆转倍数为558和1347倍,提示XDNF1-0425和XDNF8-0113具有较好的逆转作用;且在一定浓度范围内XDNF1-0425和XDNF8-0113的逆转效果随浓度的增高而增强。同时作为

29、对照组的西地那非也具有较强的逆转效果,其在100mol/L和200mol/L时与多柔比星合用时对MCF-7/AD的逆转倍数为1544和2483倍;虽然本实验所用西地那非同系物的逆转倍数小于西地那非,但是其较小的副作用作为抗肿瘤细胞多药耐药的逆转剂仍然具有很重要的临床意义。实验所选的人乳腺癌MD细胞株MCF-7/AD高表达P-gp蛋白15,P-gp蛋白是一种ATP依赖性的跨膜外流泵,它可通过细胞膜转运多种抗肿瘤药,从而限制这些抗肿瘤药进入细胞而导致肿瘤细胞耐药,因此介导肿瘤细胞多柔比星、长春新碱等药物的耐药16。我们推测XDNF1-0425和XDNF8-0113逆转作用机制可能是抑制P-gp蛋白

30、介导的细胞外排作用,并通过流式细胞术证实100mol/L和200mol/L的XDNF1-042和XDNF8-0113可以抑制MCF-7/AD细胞P-gp蛋白的外排功能,从而实现逆转MCF-7/AD细胞的耐药性。综上所述,人乳腺癌MCF-7/AD细胞对多柔比星耐药,而西地那非同系物XDNF1-0425和XDNF8-0113对其耐药性有显著的逆转作用,并且可抑制其P-gp糖蛋的外排功能。其逆转作用在蛋白表达及基因调控方面的具体机制还有待进一步的研究。【参考文献】1Detwiler A,Bloom P,Petersen A,et alMulti-drug and methi-cillin resis

31、tance of staphylococci from canine patients at a veteri-nary teaching hospital(2006-2011JVet Q,2013,32(2:60-672陈一天,封冰,陈龙邦小细胞肺癌化疗耐药研究进展J医学研究生学报,2012,25(5:515-5193赵善鹏,于泽平,顾军,等乳腺癌组织中BCA1的蛋白表达与乳腺癌的相关性分析研究J医学研究生学报,2011,24(10:1049-10534GoncalvesS,Kaiser C,Lourenco MC,et alMefloquine-ox-azolidine derivativ

32、es,derived from mefloquine and arenecarbalde-hydes:In vitro activity including against the multidrug-resistanttuberculosis strain T113JBioorg Med Chem,2012,20(1:243-2485Zhang Z,Liu Z,Ma L,et aleversal of multidrug resistance bymitochondrial targeted self-assembled nanocarrier based on stearyl-amineJ

33、Mol Pharm,2013,10(6:2426-24346Zhang LH,Wei EQONO-1078reduces NMDA-induced braininjury and vascular celladhesion molecule-1expression in ratsJActa Pharmacol Sin,2005,26(4:435-4407Shi Zhi,Tiwari AK,Shukla S,et alSildenafil reverses ABCB1and ABCG2-mediated chemotherapeutic drug resistanceJCanceres,2011,71(8:3029-30418Ding P,Tiwari AK,Ohnuma S,et alThe phosphodiesterase5inhibitor vardenafil is a potent inhibitor of ABCB1/P-glycoproteintransporterJPLoS One,2011,6(4:e193299Chen JJ,Sun YL,Tiwari AK,et alPDE5inhibitors,sildenafiland vardenafil,reverse multidrug resistance by inhibiting the ef-f