甲醛诱导MRC-5细胞适应性反应蛋白质研究

1、甲醛诱导MRC-5细胞适应性反应蛋白质研究                 作者：李习艺，庄志雄，刘建军，杨晓华，卫秦芝，黄海燕【关键词】  甲醛；适应性反应；蛋白质组摘要： 目的   研究甲醛诱导真核细胞适应性反应及其可能的机制。方法   建立甲醛刺激人胚肺成纤维细胞(MRC-5)适应性反应模型；采用AlamarBlue还原率检测细胞增殖。双向凝胶电泳分离细胞总蛋白，图像分析后选取差异蛋白点进行

2、质谱鉴定。结果   AlamarBlue检测结果表明，低剂量甲醛预刺激可诱导细胞适应性反应。双向凝胶电泳结果显示，甲醛刺激后19个蛋白斑点发生变化，肽指纹图谱及肽序列标签鉴定了其中13个蛋白斑点，已鉴定的蛋白包括二磷酸核苷酸激酶、延长因子1-，磷酸丙糖异构酶、60S酸性核糖体蛋白P0、75kDa热休克蛋白、70kD热休克蛋白样结合蛋白、钙依赖磷脂结合蛋白I、假想蛋白FLJ34423、微管-肌动蛋白交叉连接因子1、核纤层蛋白B2、ATP合成酶链、蛋白酶体亚基6，这些蛋白功能涉及转录调节、蛋白折叠、信号传导、能量代谢、细胞骨架等各个方面。结论   低剂量甲醛

3、可诱导MRC-5细胞适应性反应，多种蛋白参与细胞的适应性反应调控。关键词： 甲醛；适应性反应；蛋白质组Proteomie analysis of adaptive response induced by low concentration of formaldehyde in human embryonic fibroblasts cells   Abstract： Objective   To study the adaptive response induced by formaldehyde(FA) on eukaryocyte and its p

4、ossible mechanism.Methods   After FA treatment，AlamarBlue reducing rate was observed to determine the cell proliferation.The total cellular proteins were separated using two-dimensional gel electrophoresis and visualized by sliver staining.Gels from different batches of control and FA-trea

5、ted MRC-5 cells were analyzed for quantitative spot comparisons with the ImageMaster 2D platinum 5.0 software.The differentially expressed prorein spots were picked and digested in gel then identified by tandem mass spectrum.Results   The results of AlamarBlue reducing rate showed that low

6、 concentration of FA induced adaptive response on MRC-5 cells.Nineteen spots were changed significantly after FA treatment.Thirteen proteins were identified by peptide mass fingerprinting or peptide sequence analysis，including putative nucleoside diphosphate kinase，elongation factor 1-gamma，trioseph

7、osphate isomerase，60S acidic ribosomal protein P0，heat shock protein 75 kDa,similar to heat shock 70kD protein binding protein，annexin I，hypothetical protein FLJ34423，microtubule-actin crosslinking factor 1，lamin B2，ATP synthase alpha chain，mitochondrial precursor，proteasome subunit alpha type 6.The

8、se identified proteins involved in energy metabolism，translation and RNA processing,protein folding，redox regulation,cell structure and cell signaling.Conclusion   Adaptive response can be induced by low concentration of FA on MRC-5 cells and cellular adaptation is a complex process involv

9、ing in a modulation of diverse cellular functions.Key words： formaldehyde；adaptive response；proteomics      适应性反应（adaptive response）是机体受到低剂量环境因子预刺激后对后续高剂量的刺激产生耐受的现象。研究表明1，许多环境刺激因子低剂量接触可诱导适应性反应。但适应性反应是否为自然界普遍存在的现象，适应性反应的机制还未阐明。甲醛(FA)是常见的环境化学污染物，早期研究发现，机体接触低剂量甲醛可能诱导产生某种耐受与适应现象

10、，但尚未对其机制进行探讨2，3。本实验利用建立的甲醛适应性反应细胞模型，采用蛋白质组学技术研究了甲醛刺激后人胚肺成纤维细胞蛋白质表达差异，并用串联质谱鉴定差异蛋白，为了解甲醛诱导细胞适应性反应的分子机制提供依据。1   材料与方法11   材料   甲醛(上海标准试剂）、硫脲(美国Sigm公司)；等电聚焦胶条(13cm pH47)、尿素、二巯基苏糖醇(瑞典Amersham公司)；丙基磺酸盐、碘乙酰氨(美国USP公司)；胰蛋白酶(测序级)、丙烯酰胺(美国Promega公司)；AlamarBlue染料(美国Biosource公司)；其余试

11、剂采用国产分析纯。12   方法121   细胞培养   MRC-5细胞来源于成都肿瘤研究所，培养于改良的伊格培养基(DMEM)，含10胎牛血清，100kU/L青霉素，100mg/L链霉素。FA临用前用无血清DMEM配制。122   AlamarBlue检测细胞增殖   将细胞接种于96孔板，至对数生长期，按实验方案分别加入适应性反应剂量(10mol/L)及攻击剂量(500mol/L)的甲醛，对照组分别加入相同体积的无血清DMEM培养基，培养结束前4h每孔加入10l染料，继续培养4h用酶标仪测吸

12、光度值计算AlamarBlue还原率。123   双向凝胶电泳   参照Amersham公司技术手册及本实验室改进的技术方法4，上样量90g，上样体积250l，等电聚焦4200048000vhs，聚焦时间1921h。样品收集方案：FA染毒低剂量组为10mol/L刺激12h，高剂量组为500mol/L FA刺激5h，适应组为10mol/L FA预刺激12h后500mol/L FA刺激5h，空白对照组加入相应体积无血清DMEM，收集不同批次的细胞重复至少3次。124   图像采集和分析   染色后的双向电泳凝胶用的图像扫描仪扫描