神经营养素-3及其受体在小鼠脾的分布和基因表达

1、    神经营养素-3及其受体在小鼠脾的分布和基因表达        摘要目的在蛋白和基因水平进行神经营养素-3 (NT-3) 及其高亲和力受体 TrkC 的小鼠脾定位研究。 方法免疫组织化学和原位杂交。 结果脾内存在 NT-3、 TrkC 免疫反应阳性 (-ir) 细胞和 mRNA。 NT-3-ir 细胞属于网状细胞， 主要散布于动脉周围淋巴鞘 (PALS)、 淋巴小结和血管内壁。 TrkC-ir 细胞则分布于边缘区和红髓， 细胞性质有待确定。 原位杂交实验证实， NT-3

2、 mRNA 和 TrkC mRNA 分别与相应的免疫反应阳性细胞有一致的分布。 免疫组化和原位杂交对照实验均为阴性。 结论NT-3 和 TrkC 能够被脾内不同的细胞合成， 提示 NT-3 有可能具有调节脾功能的作用。关键词神经营养素免疫组化原位杂交脾小鼠中号 The Distribution and Gene Expression of Neurotrophin-3 inthe Spleen of MouseYang HongYang QingfengZhou ChangmanJu GongFan Ming(Institute of Basic Medical Sciences, Acade

3、my of Military Medical Science, Beijing 100850)Objective and Method The distribution of NT-3/TrkC immunoreactive (ir) cells and NT-3/TrkC mRNA in the spleen of BALB/c mice were studied using immunohistochemical and in situ hybridization methods. Results The result showed that both NT-3/TrkC-ir cells

4、 and mRNA were present in the spleen. NT-3-ir cells belonged to the stroma cells of spleen and scattered mainly in the periarterial lymphoid sheath (PALS), lymphatic follicles and the inner wall of the blood vessels. While TrkC-ir cells were found only in the marginal zone and red pulp, although the

5、 characteristic of TrkC-ir cells were remained to be identified. NT-3 mRNA and TrkC mRNA showed a very similar distribution pattern with their corresponding immunoreactive cells as revealed by in situ hybridization. The control experiment for both immunohistochemistry and in situ hybridization showe

6、d a negative staining. Conclusion The present study indicated that both NT-3 and TrkC could be synthesized by different cells of spleen, which suggested a possible regulation effect of NT-3 on the function of spleen.Key words neurotrophic factor；immunohistochemistry；in situ hybridization；spleen；mous

7、e近年来不断积累起来的研究结果表明， 传统概念上主要作用于神经系统的神经营养因子也具有免疫调节作用。 这一发现为研究神经-免疫两大系统之间的相互调节开辟了新的领域。 神经营养因子在免疫系统的合成和免疫细胞上神经营养因子受体的表达， 是它们发挥功能作用的先决条件。 目前研究较清楚的是神经生长因子 (NGF)。 已知 NGF 能够在免疫器官合成， 而且免疫系统的多种细胞能够表达功能性的 NGF 受体1，2。NT-3 是 NGF 家族的另一神经营养因子， 对交感神经元和神经脊来源的感觉神经元有着与 NGF 相似的促生长发育和促存活作用。 NT-3 的生理作用是通过与酪氨酸激酶受体 TrkC 结合而实

8、现的。 近来有报道， NT-3 和 TrkC mRNA 存在于免疫器官3， 但其细胞定位和功能尚不清楚。 本实验应用免疫组织化学和原位分子杂交方法， 在蛋白和基因水平研究 NT-3 和 TrkC 在小鼠脾的细胞定位，旨在为探讨该因子的免疫调节作用及机制提供形态学依据。1材料和方法免疫组织化学78 周的雄性 BALB/c 小鼠 6 只， 体重 2025 g。 20 g/L 异戊巴比妥钠麻醉， 经左心室灌注 4 的含 40 g/L 多聚甲醛、 0.01% (体积分数) 戊二醛、 0.2% (体积分数) 饱和苦味酸的磷酸缓冲液 (0.1 mol/L PB, pH7.4)。 10 min 后取出脾，

9、以不含戊二醛的上述固定液于 4 再固定 1216 h。 沿与脾长轴垂直方向将脾分为 4 等份， 取靠中线的一块自脾门向脾背侧做振动切片， 片厚 30 m， 收集所有切片于 0.01 mol/L 的 PBS (pH7.4) 中。 常规 ABC 法免疫组化染色， 硫酸镍铵-DAB 法呈色。 特异性抗 NGF、 TrkC 多克隆抗体由美国 Santa Cruz. 公司提供 (工作浓度 1500)。原位杂交1.2.1探针制备： 地高辛(DIG)标记及检测试剂盒均为Boehringer Mannheim公司产品。 人 NT-3 cDNA 探针的标记采用PCR 法， 引物序列为 5-TCGGTACCGTA

10、CGCGGAGCAT 和 5-CCTCTAGATTATCATGTTCTTCCGA。大鼠TrkC(5-GAAGTGGCCGTTATGGTCTG GTTGGCT GTGCCCAGGGCAT TCTTAGCAAT-3)。TrkC 寡核苷酸探针由军事医学科学院仪器中心合成，以加尾法进行DIG标记。1.2.2标本制备： 动物处理和切片收集基本同免疫组化。 所不同的是， 灌注液中不加苦味酸和戊二醛， 冰冻切片厚度为 15 m， 贴于硅化的载片之上。1.2.3杂交反应： 冰冻切片干燥后， 经 5 mmol/L MgCl2-0.1 mol/L PBS (pH7.4) 冲洗， 1 mg/L 蛋白酶 K 37 消

11、化 20 min， 0.1 mol/L 甘氨酸-5 mmol/L MgCl2-0.1 mol/L PBS (pH7.4) 终止反应， 40 g/L 多聚甲醛固定 20 min， 再用含 MgCl2 的 PBS 冲洗， 2×SSC 过渡， 梯度酒精脱水， 37 预杂交 1 h预杂交液： 50% (体积分数) 去离子甲酰胺， 5×SSC， 5×Denhardt 液， 20 g/L SDS， 1 mg/L 变性鲑精 DNA， 42 杂交 1620 h (杂交液： 预杂交液加入 100 g/L 硫酸葡聚糖和相应探针； DIG-NT-3 cDNA 探针浓度为 30 g/L，

12、 需变性； DIG-TrkC 寡核苷酸探针浓度为 1 mg/L， 无须变性， 同时还加入 100 mg/L polyA、 5 mg/L polydA)。 杂交后依次用含 50% (体积分数) 去离子甲酰胺和 1 mmol/L EDTA 的 2×SSC， 37， 2×10 min、 1×SSC 55， 2×10 min、 0.5×SSC 55， 2×10 min 漂洗 (寡核苷酸探针的漂洗均在 37 下进行并适当缩短漂洗时间)， 继之以缓冲液 1 室温漂洗 2 min， 缓冲液 2 室温孵育 30 min， 12500 标记硷性磷酸酶的

13、抗 DIG 抗体室温 2 h， 经缓冲液 1、 缓冲液 3 冲洗后， NBT/X-磷酸盐 (4.5 L NBT+3.5 L X-磷酸盐于 1 mL 缓冲液 3 中) 室温闭光显色 10 h， 1×TE 终止反应， 脱水透明封片。2结果NT-3免疫组化结果显示， NT-3 免疫反应阳性细胞主要存在于脾白髓， 属于网状细胞。 它们散在分布于动脉周围淋巴鞘 (PALS) 内， 周边较为密集 (1)。 阳性细胞大小不等、形态不规则， 大多数有形状各异的胞浆突起 (3)。 在淋巴小结生发中心内有少数阳性细胞， 它们分布稀疏， 有时甚至不可见 (1)。 圆或椭圆形， 无突起 (4)， 这类细胞的

14、性质不明。 脾内大、 小血管的内皮细胞也部分呈现 NT-3 免疫反应阳性， 红髓血管周围还常见成群的阳性细胞。 白髓、 红髓的淋巴细胞均呈免疫阴性反应 (1，3，4)。 原位杂交结果显示， 与 NT-3-ir 细胞相似， NT-3 mRNA 主要分布于脾白髓 (2)， 于脾红髓和血管内皮也可见分布。1NT-3 免疫反应阳性细胞散在分布于小鼠脾白髓的动脉周围淋巴鞘和淋巴小结内。 在淋巴小结生发中心内 (*) 有少数阳性细胞Fig 1NT-3 immunoreactive (ir) cells were scattered in the periarterial lymphoid sheath a

15、nd lymphoid follicle of spleen of mouse. Within the germinal center (*), NT-3-ir cells were sparse×1202分布于脾白髓 (WP) 的 NT-3 mRNAFig 2NT-3 mRNA were diffusely distributedin the white pulp (WP)×1203动脉周围淋巴鞘内 NT-3-ir 细胞的高倍镜下所见Fig 3High magnification of NT-3-ir cells in the periarterial lymphoid

16、sheath×12004淋巴小结生发中心内 NT-3-ir 细胞的高倍镜下所见Fig 4High magnification of NT-3-ir cells in the germinal center×1200TrkCTrkC-ir 细胞分布于边缘区和红髓， 圆或椭圆形， 无突起 (5) 性质有待确定。 PALS 和淋巴小结内的淋巴细胞呈免疫反应阴性(5)。 在个别动物， 白髓动脉周围淋巴鞘内有弥漫的染色， 但着色非常浅且重复性不好。 原位杂交显示， TrkC mRNA 分布于边缘区和红髓 (6)， 与免疫组化结果一致。5分布于边缘区和红髓的 TrkC-ir 细胞Fig

17、 5TrkC-ir cells in the marginal zone and red pulp of spleen×1206分布于边缘区和红髓的 TrkC mRNAFig 6TrkC mRNA in the marginal zone and red pulp of spleen×120对照实验结果免疫组化： 以 PBS 替代一抗和二抗均未见到阳性染色。 以正常兔血清替代一抗， 切片有极浅的非特异性着色。 原位杂交： 以不加探针的杂交液进行杂交不能得到任何信号。3讨论本实验在蛋白和基因水平均证实， NT-3 和 TrkC 存在于小鼠脾内。 由于免疫组化和原位杂交的定位结

18、果非常吻合， 两者可互为对照， 增加了结果的可信性。 NT-3 mRNA 和 TrkC mRNA 均较相应的免疫反应阳性细胞密度大， 可能表明正常情况下， NT-3 和 TrkC 基因转录量大于蛋白翻译量， 也可能与两种方法的敏感性不同有关。 作者最近用脾非淋巴细胞的培养上清孵育新生小鼠颈上神经节， 证明了脾非淋巴细胞可产生有活性的 NT-3， 从而佐证了本研究结果。PALS 内 NT-3-ir 细胞的形态与淋巴细胞完全不同， 为形状不规则且带有突起的细胞， 属于基质细胞。 脾的基质细胞构成淋巴细胞发育、 成熟的微环境， 它们主要由来自于局部成纤维细胞的网状细胞和来自于骨髓单核细胞的巨噬细胞构

19、成， 后者在 PALS 中转化为交错突细胞4。 网状细胞均匀地散布于白髓， 与自身产生的网状纤维一起构成 PALS 内微细的网架； 交错突细胞具有抗原呈递能力， 数量较网状细胞少， 周围聚集着淋巴细胞4。 网状细胞不仅构成淋巴器官的基本框架， 还参与产生细胞外基质 (ECM)， 后者所含的多种整合素 (integrins) 家族分子在免疫活性细胞之间、 淋巴细胞与抗原呈递细胞或内皮细胞之间的相互作用中起重要作用。 此外， 网状细胞还是支持、 营养神经的主要结构， 有人观察到网状细胞以类似雪旺细胞的形式包裹神经纤维5。 本实验中， PALS 中的 NT-3-ir 细胞在形态、 数量以及分布特点上

20、均接近于网状细胞。 而生发中心内的 NT-3-ir 细胞则具不同形态， 它们为圆或椭圆形， 无突起， 类似于普通巨噬细胞。脾是受交感神经支配的器官， 因而 NT-3 可能是脾交感神经结构和功能得以维持正常所必需的因子。 作者曾证实， 免疫应答中脾神经纤维的数量增加， 膨体和分枝都明显增多， 提示免疫功能活跃时神经系统的活动也可能增加6。 脾基质细胞含有 NT-3 这一结果， 有助于解释特殊功能状态下脾内神经可塑性的发生机制。 因而， 通过作用于交感神经， NT-3 可能间接起到免疫调节的作用， 因为脾交感神经的免疫调节功能是很明确的。 另外， TrkC 免疫反应产物及其 mRNA 的检出提示脾

21、内 NT-3 还可能具有直接的局部作用。 本实验中， TrkC 免疫反应产物及 TrkC mRNA 分布于脾边缘区和红髓的淋巴和巨噬细胞样细胞， 故脾内局部产生的 NT-3 有可能直接影响淋巴细胞或巨噬细胞的功能。 近来 NGF 高亲和力受体 TrkA mRNA 先后在人和大鼠单核细胞7、 活化的 CD4+ T 细胞株8、 大鼠腹腔肥大细胞9上被检出， 并且得到证明能够单独介导 (无须低亲和力受体的存在) 淋巴细胞的功能改变。 虽然目前尚缺乏 TrkC 参与免疫功能调节的直接证据， 作者最近发现 脾内 TrkC mRNA 水平在机体生理状态改变 (束缚应激) 时发生明显变化， 提示免疫器官内的

22、 NT-3/TrkC 系统可能具有免疫调节功能。本实验中我们还观察到 NT-3 在脾血管内皮细胞有丰富的表达。 NT-3 与循环系统之间有何关系尚未见文献报道， 推测可能与血管周交感神经的营养作用有关。 这一问题还有待于进一步研究。杨宏（军事医学科学院基础医学研究所， 北京 100850）杨青峰（军事医学科学院基础医学研究所， 北京 100850）赵彬（军事医学科学院基础医学研究所， 北京 100850）周长满（军事医学科学院基础医学研究所， 北京 100850）鞠躬（军事医学科学院基础医学研究所， 北京 100850）范明（军事医学科学院基础医学研究所， 北京 100850）参考文献1Lev

23、i-Montalcini R, Skaper SD, Dal Toso R. Nerve growth factor: from neurotrophin to neurokine. TINS, 1996, 19(11): 514-5202Scully JL, Otten U. NGF: not just for neurons. Cell Biology International, 1995, 19(5): 459-4693Laurenzi MA, Barbany G, Timmusk T, et al. Expresssion of mRNA encoding neurotrophins and neurotrophin receptors in rat thymus, spleen tissue and immunocompetent cells. Eur J Biochem, 1994, 223(3): 733-7414Weiss L, Sakai H. The hematopoietic stroma. Am J Anat, 1984, 170(3): 447-4635Blue J, Weiss L. Vascular pathway in non-