积雪草苷对脂多糖诱导急性肺损伤的白细胞介素-10和血红素氧合

1、积雪草苷对脂多糖诱导急性肺损伤的白细胞介素-10和血红素氧合酶-1影响研究                         作者：章卓 姜鲜 万敬员 李华 李亮 张红【摘要】  目的观察积雪草苷对脂多糖（LPS）诱导急性肺损伤（ALI）白细胞介素-10（IL-10）、血红素氧合酶（HO-1）影响。方法40只Balb/c小鼠随机分为空白组，模型组，积

2、雪草苷5,15,45 mg?kg-15组，每组8只。脂多糖（2.5 mg?kg-1）气管滴注造急性肺损伤模型，24 h后处死小鼠，免疫印迹法检测肺组织HO-1蛋白表达，ELISA法检测血浆IL-10表达。结果积雪草苷各剂量组呈剂量依赖性增加脂多糖所致急性肺损伤模型肺组织HO-1蛋白和IL-10表达。结论积雪草苷对LPS诱导急性肺损伤保护效应可能与促进HO-1表达和IL-10含量有关。 【关键词】  积雪草苷 脂多糖 急性肺损伤 抗炎因子Abstract：ObjectiveTo observe the effect of asiaticoside (AS) on HO-1 and IL

3、-10 of acute lung injury(ALI) induced by lipopolysaccharides (LPS).Methods40 Balb/c mice were randomly divided into control , model, model + asiaticoside 5,15,45 mg?kg-1 groups. Model of ALI was established by intratracheal instillation of LPS 20 l（2.5 mg?kg1）.Mice were killed 24 h later, and 

4、HO-1 protein of lung was detected by western-blot . The content of IL-10 in plasma was detected by enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA). ResultsAS could increase the contents of HO-1 of lung and IL-10 in plasma in adose -dependent manner.ConclusionAS has protective effect on ALI induced by LPS a

5、nd the mechansim may be related with increasing the coutents of HO-1 of lung and IL-10 in plasma.Key words：Aisaticoside;  Lipopolysaccharide;   Acute lung injury, Anti-inflammatory factors    急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是以肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞广泛损伤为病理特征的一种失控的炎症反应1，起病急而严重，国内发病率和

6、病死率达20%40%，尤其在ICU病房中更是高达50左右2。体内失控性释放的大量炎症介质与抗炎因子间的平衡决定了ALI的发展，血红素氧合酶-1(HO-1)和白细胞介素-10(IL-10)作为炎症过程中重要的两个抗炎介质，在ALI发病过程中扮演着重要角色。积雪草苷（Asiaticoside，AS）为积雪草Centella asiatica (L.) Urb.提取物三萜皂苷的主要成分之一3 ，目前积雪草苷研究主要集中在对抑郁和伤口愈合的治疗上，研究显示积雪草苷对革兰阴性菌感染，在10 mg/kg即可抑制NO等炎症因子表达4。但对于抗炎因子研究还未见相关报道。本课题组前期研究已经证实积雪草苷对脂多糖

7、（LPS）诱导ALI有保护作用，因此本研究通过复制LPS诱导的ALI小鼠模型，观察血清IL-10和肺组织匀浆HO-1的表达，明确积雪草苷对LPS诱导的ALI保护效应是否与促进HO-1 和IL-10表达有关。1  器材1.1  药品与试剂积雪草苷，广西昌洲天然产物开发有限公司，批号，20061478,纯度95。LPS（sigma，L2880）。BCA试剂盒，Pierce公司。IL-10酶联免疫吸附法试剂盒，Cayman化学公司。兔抗鼠-actin和兔抗鼠HO-1 IgG单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体，Abcam公司。1.2  动物Balb/c小鼠

8、，雌雄各半，1822 g，10周龄，由重庆医科大学动物中心提供,合格证号：SYXK(渝)2002007。1.3   仪器3K30型超低温离心机（sigma,德国），PAC300型垂直型电泳槽和湿式电转膜槽转膜仪（bio-rad,美国）， 550型酶标仪（bio-rad,美国）。2   方法2.1   分组与给药将40只Balb/c小鼠随机分为空白组、模型组（LPS 2.5 mg?kg-1）及积雪草苷小、中、大（5，15，45 mg?kg-1）剂量组，每组8只。积雪草苷溶解于0.5羧基纤维素钠。药物组造模前连续灌胃3 d，空白组和模型组

9、给予等量蒸馏水。2.2   急性肺损伤模型的建立53水合氯醛(0.3 g?kg-1，ip)麻醉小鼠，颈部正中切口5 mm，分离气管，微量注射器由气管向肺方向滴注LPS溶液（2.5 mg?kg-1），1 min内滴注完毕，消毒缝合切口，小鼠保温护理。2.3   免疫印迹法检测HO-1蛋白表达ALI建模后24 h处死动物，取肺组织放于EP管中，-80保存。准确称量肺组织100 mg，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液1 ml，冰上匀浆，超声波断裂蛋白，转入1.5 ml EP管中，4，12 000 g×15 min，吸取上清，BCA法测量蛋白浓度。配好

10、4浓缩胶和10分离胶后加样，SDS-PAGE电泳，配转移液，将滤纸、醋酸纤维膜浸泡其中，按滤纸、硝酸纤维膜、凝胶、滤纸的顺序叠放于电转膜板上，排除气泡，100 v转膜120 min，转膜后将硝酸纤维膜放入封闭液中，摇床缓慢摇动，封闭1.5 h，加入一抗，4孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗，孵育，洗膜。暗室中加入显色剂，压片显影，以-actin为内参，用图像分析仪对免疫反应条带进行扫描，蛋白条带吸光度值用Image pro-plus软件测定。2.4  ELISA法检测IL-10表达ALI建模后24 h处死动物，眼球取血，1 500 g×10 min,取血浆放于EP管中，-

11、80保存。按照EIA试剂盒说明书测定血浆IL-10水平，酶标仪上读取A450 nm。2.5    统计学处理 实验数据以 ±s表示，数据分析采用单因素方差分析，组间均值比较采用SNK法。P<0.05表示有统计学差异。统计学数据用SPSS12.0软件分析处理。百事通3   结果3.1  积雪草苷对HO-1蛋白表达的影响LPS致ALI小鼠模型肺组织HO-1有表达，其灰度值高于空白组。AS各组灰度值则明显高于模型组和空白组。同模型组比较，AS 5，15,45 mg?kg-1组表达增加，灰度值比较有统计学意义（P<0.0

12、5）。见图1，表1。图1  积雪草苷对LPS致ALI小鼠肺HO-1表达的影响（略）3.2  积雪草苷对IL-10影响与空白组比较，模型组IL-10表达增加，但明显低于AS各组。同模型组比较，AS 5,15 mg?kg-1组IL-10表达增加，有统计学意义（P<0.05）。AS 45 mg?kg-1增加明显，有显著统计学意义（P<0.01）。见表1。表1  积雪草苷对ALI小鼠血浆IL-10和肺组织HO-1蛋白表达灰度值影响（略）与模型组比较，* P0.05,* P0.014   讨论    LPS是引起

13、ALI的常见因素。ALI发病急而严重，尽管临床上采取彻底引流局部感染灶、选用强力抗生素、进行机械通气以及呼吸末正压通气(PEEP)纠正低氧血症等措施进行治疗，但目前对ALI尚无特殊的治疗手段改善其死亡率2。LPS感染致ALI过程中，多形核中性粒细胞在肺微血管内的募集和激活起着关键作用，促发了一系列复杂细胞因子网络启动，产生炎症反应和血管损伤，同时释放抗炎因子。促炎因子增加，机体损伤将进一步加剧，抗炎因子增加则炎症减轻，因此促炎细胞因子和抗炎因子的平衡也决定了ALI的转归和严重程度6。   抗炎因子IL-10主要是由单核巨噬细胞、T细胞、B细胞产生，研究显示7IL-

14、10具有降低肺泡毛细血管膜通透性，减少肺内聚集的PMN，从而减轻LPS致ALI的作用。另外，炎性细胞因子也可调节IL-l0的产生,研究显示IL-10对SIR及代偿性抗炎反应综合征有双重作用，IL-10一方面抑制上述炎症介质IL-6,TNF的作用，同时也上调IL-1RA，sTNFR等抗炎介质，使体内炎症介质/抗炎介质达到平衡8。临床资料也证实在ALI早期IL-10含量低，晚期IL-10增加，存活病人的IL-10高，病人的死亡率与IL-10呈负相关9。另一个重要的抗炎介质血红素加氧酶对身体多种组织具有细胞保护作用，HO-1是其中的一种同工酶,能降解催化产生自由基和脂质过氧化的血红素，直接参与清除自

15、由基，抑制前炎症介质产生，增加抗炎介质的表达是机体内源性抗氧化、抗炎和抗损伤的重要保护系统。资料表明，大鼠静脉注入LPS，应用HO-1特异阻断剂可使ALI大鼠肺组织HO-1mRNA表达受抑，加重肺损伤和提高损伤评分10，因此本研究选择观察积雪草苷对ALI 的保护作用是否与HO-1和IL-10的表达有关。    结果显示积雪草苷各剂量组均增加肺组织HO-1蛋白表达和IL-10的含量，提示其保护效应可能与增加抗炎因子IL-10和HO-1的表达有关，但对于具体机制尚待进一步研究。【参考文献】  1 钱桂生.急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征研究现状与展望J.解放军

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