白细胞介素-4基因修饰Raji细胞促进肿瘤特异细胞毒性T细胞

1、    白细胞介素-4基因修饰Raji细胞 促进肿瘤特异细胞毒性T细胞杀伤活性        【摘要】目的探讨人白细胞介素(IL)-4基因修饰对伯基特淋巴瘤细胞株Raji的体外生物学特性、肿瘤特异性细胞毒性T细胞（CTL）杀伤活性的影响及其机制。方法采用逆转录病毒介导基因转染法将人IL-4 cDNA导入Raji株并筛选获得高效价表达IL-4的克隆，观察IL-4表达克隆形态学特征、体外增殖反应及其诱导的外周血单个核细胞(PBMC)增殖反应和IL-2、干扰素(IFN-)

2、基因表达及CTL杀伤活性。结果IL-4基因修饰对Raji的体外生物学特性无明显影响，但明显促进正常人PBMC增殖及IL-2、IFN-基因表达，其诱导建立的CTL杀伤活性明显增强，效应细胞：靶细胞比例为301时，IL-4基因修饰可使Raji细胞诱导的CTL杀伤活性上升23倍。结论外源性IL-4基因表达产物可能作用于瘤细胞和（或）PBMC，通过诱导IL-2、IFN-等细胞因子促进 CTL反应，并增强其杀伤活性。【关键词】白细胞介素-4伯基特淋巴瘤基因T淋巴细胞，细胞毒性 Stimulation with IL-4 gene modified Raji cells enhances killing

3、activity of tumor-specific cytotoxic T lymphocyteZHAO Xiaodong, LI Chengrong, YANG Xiqiang, et al. Childrens Hospital, Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400014【Abstract】ObjectiveEffects of interleukin-4 (IL-4) gene modification of biological characteristics of Raji cell line and kil

4、ling activity of Raji-specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) were investigated. MethodsIL-4 cDNA was amplified from a plasmid, pCD-hIL-4, by polymerase chain reaction (PCR) and transferred into Raji cells via retrovirus-mediated gene transfection method. Proliferation of IL-4-producing Raji clones an

5、d PBMC, IL-2 and IFN- mRNA synthesis and killing activity of Raji cell-induced CTL were determined. ResultsStimulation with IL-4 gene-modified Raji cell increased proliferation and IL-2, IFN- mRNA synthesis of normal PBMC, which could not be blocked by anti-IL-4 monoclonal antibody. The killing acti

6、vity of CTL induced by IL-4 gene modified Raji clones was much stronger than that of controls. ConclusionIL-4 gene modification is capable of enhancing killing activity of Raji-specific CTL by means of up-regulating expression of IL-2 and creating a more suitable environment for antigen-presenting,

7、establishment and maintenance of killing function of CTL.【Key words】Interleukin-4Burkitts lymphomaGenesT-lymphocytes, cytotoxic恶性淋巴瘤在儿科临床实践中并不少见，目前的治疗手段尚未取得令人满意的效果。采用细胞因子基因修饰的肿瘤细胞疫苗激发机体抗肿瘤免疫功能，最终彻底清除肿瘤是一种具有潜在临床价值的新方法。将其与手术切除、放疗、化疗结合进行治疗可望大大改善恶性淋巴瘤患儿的预后。本研究将白细胞介素(IL-4)基因导入伯基特（Burkitt）淋巴瘤株Raji，观察其体外生物

8、学特性的改变及对 T细胞功能的影响，旨在为恶性淋巴瘤的基因与免疫治疗提供新线索。材料及方法一、目的基因、载体及宿主菌以含人IL-4 cDNA全序列的质粒PCD-hIL-4为模板，用引物Sense 5-AACTCGAGTTAATGGGTCTCA CCTCCCAA-3和Antisense 5-AGGGATCCTATTCAG CTCGAACACTTTGA-3通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得IL-4 cDNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收、纯化该片段。用双脱氧链终止法测序。逆转录病毒载体(PLXSN)由Miller(USA)赠送，长约 5 900碱基对。宿主菌大肠杆菌Mc 1 061株由作者单位的免疫室保

9、存。二、主要试剂、细胞株及其来源内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶及逆转录酶均购自Promega公司；脱氧三磷酸核苷(dNTP)、Polybrene、细胞培养基RPMI 1 640、DMEM和克隆筛选试剂G 418购自Gibco公司；脂质体转染试剂Dosper及重组IL-4购自Boehringer Mannheim公司；51铬酸钠(51Cr)购自美国Ameshan公司, 3H-TdR购自中国同位素公司，IL-2、干扰素(IFN-) PCR引物购自上海细胞生物研究所；重组 IL-4（rIL-4）、鼠抗人IL-4单克隆抗体及IL-4酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自 Gen

10、zyme公司。病毒包装细胞株PA317及病毒滴度鉴定细胞株 NIH3T3来自第三军医大学分子生物室， Raji为本室常规传代培养。三、重组逆转录病毒载体的构建、包装、筛选及感染人IL-4重组逆转录病毒载体构建策略如1所示。1IL-4重组逆转录病毒载体构建示意碱裂解法抽提质粒，酶切、连接、鉴定及细菌转化等步骤均按 Sambrook等1介绍的标准方法操作。具体步骤为：用平端内切酶 HpaI使载体线性化。酚：氯仿抽提纯化后与 PCR反应扩增回收得到的目的基因片段，在T4 DNA连接酶催化作用下进行连接反应。连接反应产物转化感受态大肠杆菌-Mc1 061，将其接种于琼脂平板，待菌落形成后进行大肠杆菌扩

11、增，抽提质粒，酶切后琼脂糖电泳鉴定。脂质体介导基因转染、病毒滴度鉴定及感染 Raji细胞方法见参考文献2。四、表达IL-4的Raji细胞克隆筛选及体外生物学特性观察用G 418筛选转基因 Raji细胞克隆1个月，收集抗性细胞克隆上清液用ELISA法检测IL-4表达水平。在普通光学显微镜下观察抗性Raji克隆形态学特征，用3H-TdR掺入法测定其体外增殖活性。五、Raji细胞诱导正常人外周血单个核细胞（PBMC）增殖及IL-2、IFN-基因表达常规分离正常人PBMC，调细胞浓度至1×106/ml，加100 l入55孔板，不同组别加入经丝裂霉素C(40 g/L×106细胞，37

12、，1小时)处理的转基因或对照 Raji细胞。 IL-4单克隆抗体(简称单抗)阻断组加入终浓度为0.5 g/ml的鼠抗人 IL-4单抗,重组 IL-4组加入终浓度为0.1 g/ml的IL-4，37、5%二氧化碳(CO2)培养24小时。培养结束前16小时加入3H-TdR，液闪计数每分钟脉冲数(cpm)值。另取1×106 PBMC加入24孔板，分别加入丝裂霉素C处理的肿瘤细胞1×105/孔（100 l），置37、5%CO2孵箱中培养12、24、48和72小时后抽提总RNA，用RT-PCR检测IL-2和IFN-基因表达。六、Raji特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)建立及其杀伤活性

13、测定参照Thomas等3介绍的方法。用 51Cr标记野生型肿瘤细胞（100 ci/1×106细胞，37过夜），PBS缓冲液洗涤3次后将浓度调至1×105/ml作为靶细胞。采用4小时 51Cr释放法测定CTL杀伤活性。于96孔培养板中加入不同比例的效应细胞和靶细胞（每种比例重复3孔），37、5%CO2孵育4小时，1 500 r/min离心5分钟，收集上清用-计数仪测定其cpm值。按下式计算CTL杀伤活性，以杀伤率%表示：%杀伤活性=×100结果一、重组IL-4逆转录病毒载体的构建用核酸内切酶SacI消化载体出现2片段，消化重组体后2片段大小相近，无法区分；DNA内切

14、酶EcoR消化重组体出现367 bp小片段，消化载体后无此片段出现，证实正向重组的 IL-4逆转录病毒构建成功（2）。2重组IL-4逆转录病毒载体酶切鉴定谱二、Raji株表达 IL-4水平及其体外生物学特征各株Raji细胞克隆IL-4表达水平如表1所示。导入IL-4cDNA的Raji细胞产生IL-4的最高水平24小时可达134.5 pg/106细胞。普通光学显微镜下观察IL-4高表达克隆细胞形态、大小与野生型Raji及仅导入载体的Raji细胞(Raji-neo)相比无明显变化。其体外增殖反应水平与对照组比较亦无明显差异。表1Raji细胞表达IL-4水平及其体外增殖反应细胞株IL-4表达水平(p

15、g/106细胞24h)增殖反应(cpm)未加组rIL-4组野生型Raji02 2132 376Raji-neo02 4372 643R-IL-412 678-R-IL-422 734-R-IL-432 765-R-IL-441 988-注：-示未检测；每一实验至少重复3次；R-IL-414示IL-4基因修饰的Raji株，下同三、Raji细胞诱导的正常人PBMC增殖反应如表2所示，表达IL-4的4株Raji克隆诱导的正常人PBMC增殖反应明显强于野生型Raji及Raji-neo诱导者，IL-4单抗不能阻断。重组人IL-4加入培养系统虽可使PBMC增殖反应增强，但其程度远不及表达IL-4的Raji

16、克隆。表2Raji细胞诱导的正常人PBMC体外增殖反应(cpm)诱导细胞株未加组IL-4单抗组rIL-4组空白对照412-564野生型Raji619-1 386Raji-neo546-1 748R-IL-413 8653 647-R-IL-423 4673 282-R-IL-433 1803 254-R-IL-442 7892 403-四、Raji细胞诱导正常人PBMC IL-2、IFN-基因表达IL-4基因修饰的Raji细胞可诱导正常人PBMC IL-2和IFN-基因表达。IL-2基因表达在刺激后12小时即可检测，维持至48小时开始减弱；IFN-基因刺激后12小时有较弱表达，至24小时达表达

17、高峰，48小时后开始减弱（3、4）。野生型Raji、Raji-neo、加入rIL-4共培养的Raji及单独加入rIL-4均未能诱导上述基因表达。 1：Raji-rIL-4；2：Raji-neo；3：R-IL-4，24h；4：R-IL-4；5：Marker3R-IL-41诱导的正常人PBMC IL-2基因表达1：Raji+rIL-4；2：Raji-neo；3：R-IL-4，24h；4：R-IL-41；12h；5：Marker4R-Il-41诱导的正常人PBMC IFN-基因表达五、CTL的杀伤活性野生型Raji细胞和Raji-neo仅能诱导轻度CTL杀伤活性。各种效应细胞：靶细胞比例两者诱导的杀

18、伤活性无显著差异。R-IL-41细胞诱导的CTL杀伤活性明显增强，并随效应细胞：靶细胞比例的升高而增强效应细胞靶细胞比例为301时Raji-neo、野生型Raji及R-IL-41诱导的CTL杀伤效率分别为(20.3±6.2)%、(20.8±4.3)%和(48.8±10.4)%。 讨论细胞因子与机体抗肿瘤免疫反应密切相关，已证实诸多细胞因子在肿瘤局部表达可激发机体抗肿瘤免疫反应，提示细胞因子基因修饰肿瘤疫苗具有潜在的临床应用前景。 IL-4是一种具有多种生物学功能的细胞因子，前期研究发现 IL-4基因修饰的小鼠实体瘤细胞可增强宿主的抗肿瘤免疫反应4；重组 IL-4可

19、明显抑制新鲜分离的非何杰金淋巴瘤细胞体外增殖反应5，提示 IL-4既可能直接作用于肿瘤细胞，抑制其增殖或促进其细胞凋亡过程6，亦可上调机体抗肿瘤免疫反应。本研究发现 IL-4基因修饰 Raji细胞诱导的正常人PBMC增殖反应及 IL-2， IFN-基因表达明显增强，而加入培养系统的重组 IL-4却无此作用。提示由肿瘤细胞自分泌的 IL-4可能更有效地作用于瘤细胞本身和(或) PBMC，最终促进PBMC增殖并表达一些有利于抗原提呈、 CTL反应建立及 CTL杀伤活性的细胞因子产生，从而有利于机体有效清除肿瘤。IL-2能促进 T细胞增殖，诱导 T细胞分泌一系列细胞因子，亦为CD8+CTL维持杀伤活

20、性必需的生长因子，故推测其可能为 IL-4基因修饰瘤苗促进 CTL杀伤活性的关键作用环节。IL-4主要来源于TH2细胞，具有诱导T细胞向TH2方向分化并产生TH2类细胞因子的功能。本研究发现IL-4基因修饰瘤苗主要诱导正常人PBMC产生 IL-2、 IFN-等TH1细胞类细胞因子, 而用rIL-4或rIL-4加肿瘤细胞则未能诱导PBMC产生上述细胞因子, 提示肿瘤细胞分泌的 IL-4可能并未直接作用于 T细胞。我们推测IL-4基因修饰 Raji细胞所致的继发因素,如肿瘤细胞膜表面某些抗原的改变, 可能激活 T淋巴细胞受体, 从而诱导建立TH1应答。 CTL是抗肿瘤免疫网络中最特异、最重要的效应细胞，本研究结果为 IL-4基因修饰淋巴瘤疫苗的使用提供了线索，但尚需在体内进一步证实。本课题为国家自然科学基金资助（编号：39470733）及卫生部科研课题基金资助（编号：96-1-366）作者单位：400014 重庆医科大学儿童医院参考文献1Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press