甲状腺转录因子-1对鸡胚尿囊膜血管生成的实验研究4400字

1、甲状腺转录因子-1对鸡胚尿囊膜血管生成的实验研究4400字 作者：李晓莞，李正禄，张学武 【摘要】 目的研究甲状腺转录因子-1（TTF1）对鸡胚尿囊膜（CAM）血管生成的影响。方法利用CAM 模型，60枚新鲜种蛋随机分为3组：PBS组，25 g/ml TTF1组，50 g/ml TTF1组，每组20只。种蛋消毒后，放入37.8恒温箱内孵育6 d，暴露尿囊 作者：李晓莞，李正禄，张学武【摘要】 目的研究甲状腺转录因子-1（TTF1）对鸡胚尿囊膜（CAM）血管生成的影响。方法利用CAM 模型，60枚新鲜种蛋随机分为3组：PBS组，25 g/ml TTF1组，50 g/ml TTF1组，每组20只。

2、种蛋消毒后，放入37.8恒温箱内孵育6 d，暴露尿囊膜，将含有待测品的滤纸放在尿囊膜血管较少部位，继续孵育2 d，以滤纸为中心，把膜剪下，固定，拍照并记录各组CAM 血管生长及血管数目情况。结果PBS组CAM血管及其网络清晰可见，生长良好；给药组血管数目较PBS组明显减少，血管结构模糊，颜色变浅、苍白。结论TTF1对CAM血管生成有明显的抑制作用。 【关键词】 甲状腺转录因子-1； 鸡胚尿囊膜； 血管生成 Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of compound extract from Sorbaria sorbifolia (SS)o

3、n angiogenesis in the chick chorioallantoic membrane(CAM). MethodsSixty fresh chicken eggs were divided into three groups: PBS group, 25 g/ml TTF1 group, 50 g/ml TTF1 group, 20 in each group. After disinfection, the eggs were incubated for eight days in a constant temperature box with the temperatur

4、e being controlled within 37.8, then exposed CAM, laid the filter papers with specimen on the CAM and the eggs were incubated for another two days. The CAM, was cut , the photos were taken and the angiogenesis in the CAM was observedResultsThere were many CAM vessels in the PBS group and the blood v

5、essel net could be seen clearly. The number of CAM vessels in the TTF1 groups was much less than that in the PBS group. Furthermore, the frame of the vessels was not clear, and the color was obscure.ConclusionTTF1 can obviously restrain the angiogenes in CAM. Key words： TTF1； Chick embryo； Anqiogene

6、sisTTF1是从生长在长白山珍珠梅（Sorbaria sorbifolia）中分离得到的新的单体化合物1，化学名称是5，2，4-三羟基-6，7，5-三甲氧基黄酮。珍珠梅属蔷薇科植物，广泛分布于云南、贵州、四川、甘肃、宁夏及东北，有活血化淤、消肿止痛、治骨折及跌打损伤的作用2。新生毛细血管的形成对原发肿瘤细胞本身的增殖和生长是必不可少的，同时也是肿瘤侵袭转移的必需条件。前期实验已证实长白山珍珠梅具有促分化、诱导肿瘤细胞凋亡、调节肿瘤相关基因表达等作用。也曾有研究报道珍珠梅提取物对小鼠S180肉瘤的抑制作用1。本实验拟通过研究TTF1对鸡胚尿囊膜血管生成的影响，以进一步证实其抗血管生成作用以及探

7、究抗肿瘤途径及作用机制。 1 材料与仪器 1.1 种蛋新鲜种蛋，购于南京天邦生物科技有限公司。 1.2 试剂定性滤纸：Whatman公司产品，货号：1001047。PARAFILM封口膜，紫外消毒备用。甲醇和丙酮：南京化学试剂有限公司，分析纯。磷酸缓冲液（PBS）：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4。 1.3 仪器及设备SANYO恒温孵育箱；数码相机为佳能公司产品；BA400/500型解剖镜购于麦克奥迪实业有限公司。 1.4 样品珍珠梅采集于吉林省延吉市市郊，由延边大学药学院刘永镇教授鉴定为真品。TT

8、F1：珍珠梅10 kg经水提醇沉后，上大孔吸附树脂，70%醇洗脱部分浓缩得到药用部位浸膏，加入蒸馏水，加热搅拌，过滤，分成水溶和水不溶两部分，水溶部分用氯仿、醋酸乙酯溶剂依次萃取，水不溶部分用氯仿、醋酸乙酯溶剂依次超声提取，合并氯仿部分，以氯仿-甲醇为洗脱溶剂梯度洗脱，经硅胶柱色谱得到TTF1。TTF1均用DMSO溶解，PBS稀释，DMSO终浓度为0.1%。 2 方法 2.1 方法参考文献3，4制备样品载体，将种蛋按不同分组进行药物处理，并判断结果。 2.2 样品载体的制备将Whatman滤纸用打孔器制成直径5 mm的圆片，高压灭菌备用。在无菌条件下，将5 ，10 l的TTF1（终浓度为5 g

9、/l）均匀涂在滤纸上，阴性对照组涂布同体积的PBS，自然风干备用。 2.3 实验分组及药物处理将60只新鲜种蛋随机分为PBS组，25 g/ml TTF1组，50 g/ml TTF1组，每组20只。种蛋消毒后，放入37.8恒温孵育箱，气室向上，转动3次/d。孵育至第8天的鸡胚，酒精擦拭后静置20 min。用剪刀和镊子在气室部位开窗（1.5 cm1.5 cm），暴露出卵壳膜。选定加药部位，用注射器针尖轻轻挑破卵壳膜，滴加1滴PBS。轻轻剥离卵壳膜，暴露出尿囊膜。将含药滤纸放在尿囊膜血管较少部位。无菌封口膜封口，放在孵育箱中继续孵育2 d。揭开封口膜，将窗口扩大，注入甲醇和丙酮的混合液（11）室温固

10、定15 min。待血管凝固后，以滤纸为中心把膜剪下，放入盛有少量水的平皿上展开，阴干，采用解剖显微镜观察实验部位边缘5 mm范围内的血管，计数并拍照。 2.4 统计方法应用SPSS11.5统计软件进行q检验和方差分析，数据采用 s表示。 3 结果 3.1 TTF1各组对CAM血管数目生长的影响TTF1不同剂量组和PBS组作用CAM后，给药组CAM血管数目较PBS组明显减少，有明显差异，具有统计学意义（P0.05或P0.01），提示TTF1具有一定的抑制血管生成的作用。结果见表1 3 结果3.1 TTF1各组对CAM血管数目生长的影响TTF1不同剂量组和PBS组作用CAM后，给药组CAM血管数目

11、较PBS组明显减少，有明显差异，具有统计学意义（P0.05或P0.01），提示TTF1具有一定的抑制血管生成的作用。结果见表1。表1 不同剂量TTF1对CAM血管数目的影响（略） 3.2 形态学观察在解剖显微镜下，可见PBS组血管网络清晰，呈叶脉样，放射性生长，主血管粗壮，长势旺盛。TTF1剂量组的血管生成明显受抑，载体周围血管网模糊，颜色变浅、苍白，血管分枝处多处断裂，密度减少，个别CAM实验作用部位的新生血管结构破坏，甚至未见血管。结果见图1。 4 结果自20世纪70年代Folkman首先提出抗血管生成(anti-angiogenesis)理论至今，人们对血管形成的机制等方面的研究已取得较

12、大进展。有关研究表明，恶性肿瘤的无限制侵袭性生长及其转移依赖于血管新生，血管新生是指在血管周围生成毛细血管的过程。在正常情况下，宿主能控制血管新生，机体在短时间内打开或关闭控制系统，但是肿瘤组织缺乏控制血管新生的调节机制，因而，控制正常组织血管新生的机制不能控制肿瘤的血管新生5。当肿瘤体积增至23 mm3时，肿瘤已不能单纯依靠弥散获取氧气及营养物质，如果无新生毛细血管长入，则肿瘤组织将保持休眠状态或发生退化，因此，控制血管新生已成为治疗肿瘤的一个靶点。鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic memBrahe，CAM)是研究血管形成与抗血管形成的理想体内模型，以鸡胚绒毛尿

13、囊膜研究血管新生药物的体内模型成为热点问题6。一般情况下，血管新生主要发生在胚胎发育过程中，在某些病理情况下，如损伤修复、炎症等也常伴随发生血管新生，特别是肿瘤生长和转移与血管新生密切相关。在血管生成实验中，主要的体内实验有CAM和卵黄囊膜法等，在众多血管生成模型中CAM因实验材料易得，操作简便，实验周期短及结果易于观察等优点，成为研究药物抗血管生成作用的最常用体内模型。有研究显示，鸡胚发育的第812天，这一时期CAM中的血管生长处于高峰状态7。因此，本实验研究选择鸡胚培育的第8天给药，以观察TTF1抑制血管生长的影响。研究发现TTF1对血管生成有明显的抑制作用。但是，对鸡胚尿囊膜血管的新生作

14、用机制尚不明确，药物究竟影响了血管新生通路的哪些环节发挥的作用，是影响了血管新生的关键因子血管内皮生长因子(VEGF)形成和释放，还是影响MAKP信号转导通路中的ERK通路，这些问题有待于进一步研究。 【参考文献】1张学武，张玉梅，关丽萍，等.珍珠梅活性成分的提取分离及体内抑瘤作用的研究J.中药材,2004,27(1): 36.2江苏新医学院.中药大辞典M.上海:上海科学技术出版社，1994: 8.3呼 群，宁 涛，苏秀兰.鸡胚绒毛尿囊膜技术的改进J. 北京大学学报(医学版)，2001，33(4)：383.4贺国安，罗进贤，张添元，等改进的鸡胚绒毛尿囊膜技术-无气室孵育法.J中山大学学报(自然科学版)，2003，42(2)：126.5薛庆善. 体外培养的原理与技术M北京：科学出版社，2001: 2.6Waltenberger J，Claessen-Welsh L，Siegbahn A,et al. Different signal transduct