浅谈紧密连接蛋白claudin-6通过p38 MAPK途径诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡

1、浅谈紧密连接蛋白claudin-6通过p38 MAPK途径诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡    紧密连接是内皮和上皮细胞之间重要的连接形式，对于维持细胞极性和通透性方面发挥着重要作用。Claudins是构成紧密连接的一种重要的跨膜蛋白。近年的研究表明，紧密连接参与了细胞信号转导过程调节了细胞的增殖和凋亡。Claudin蛋白通过胞浆区的羧基末端的PDZ结合序列与细胞骨架蛋白或信号蛋白相结合调节细胞的生理活动。Claudin-6为claudin蛋白家族成员之一。我们在前期工作中发现，与对照相比稳定过表达claudin-6的MCF-7细胞生长缓慢，且流式细胞术检

2、测细胞存在着一定的死亡，为证实这种死亡部分是由凋亡造成的，我们检测了转染claudin-6前后细胞的凋亡及凋亡相关基因的表达情况，本论文初步探讨了claudin-6在MCF-7细胞凋亡中的作用。 参考更多临床药学论文 1 材料和方法    1.1 材料 稳定过表达claudin-6的MCF-7细胞为本室保存。原位检测细胞凋亡的TUNEL试剂盒和DAPI染料购自德国Roche公司。Annexin- /PI apoptosis 试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。 TRIZOL reagent和RT-PCR试剂盒为TaKaRa公司产品。 Dulbecco

3、s modified Eagles medium (DMEM) 高糖培养基、胎牛血清和G418均为Gibco 公司产品。抗人磷酸化p38抗体购自Cell SignalingTechnology。信号转导通路抑制剂SB203580购自Calbiochem公司。1.2 方法    1.2.1 实验分组：以下实验均分为三组，对照组（control）为未转染的MCF-7细胞；空载组（vector）为转染空载体的MCF-7细胞；实验组为稳定表达claudin-6的MCF-7细胞组（C1-C2） 。所有实验至少重复三次。1.2.2 TUNEL法检测细胞凋亡 按TUN

4、EL试剂盒说明进行：取细胞爬片，用胃蛋白酶37消化 60min；PBS 冲洗，加 50l 的0.3H2O2 甲醇溶液，PBS冲洗；加 25l 的 TUNEL 反应溶液，37孵育60min；PBS 冲洗，加 25l 的辣根过氧化物酶抗体，湿盒中 37孵育60min；PBS 冲洗，加一滴新鲜配制的DAB 室温孵育10min，PBS 冲洗；苏木精复染核，酒精脱水，干燥；中性树胶封片，光镜观察，细胞核棕色者为阳性。1.2.3 Annexin- /PI 双染法检测细胞凋亡 按试剂盒说明书操作：常规胰酶消化细胞并计数，调整细胞浓度至 5×105-1×106个/ml。取 1ml细胞 10

5、00rpm，4离心 10min 后弃上清。加入1ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮， 1000rpm， 4离心 10min 后弃上清。将细胞重悬于200ul Binding Buffer，加入10ul AnnexinV-FITC和 5ul PI，轻轻混匀，避光室温反应 15min 或 4反应30min后将染色后的细胞悬液加入 96 孔板中，在 1h 内用荧光显微镜检测。阳性结果判断：绿色为早期凋亡细胞，红色为晚期凋亡细胞。1.2.4 DAPI染色法检测细胞凋亡 取固定好的细胞爬片，常规水化后滴加浓度为100ng/ml的DAPI染液，室温染色10min，流水冲去染液，滤纸吸除多余水分，加一滴荧光

6、封片液，置于荧光显微镜下观察，激发波长360-400nm。阳性结果判断：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期，期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态； a 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化； b 期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。1.2.5 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测Bcl-2和Bax mRNA水平 细胞培养至完全汇合时，使用TaKaRa TRIZOL Reagent Kit，按说明书提取细胞总RNA进行RT-PCR反应。从Primer Bank中获得人类Bcl-2和Bax基因引物序列。人Bcl-2上游引物为： 5- CCAAGAATGCAAAGCACA

7、CTG-3 ，下游引物：5-CCCAGCCTCCGTTATCCTG -3，扩增片段为711bp；Bax上游引物为：5-CTGGACAGTAACATGGAGCTG-3 ，下游引物为 5-GGCGTCCCAAAGTAGGAGA-3，扩增片段为296bp。人-actin作为内参照，引物序列如下：上游为5-CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC-3，下游为5-CTCCTT AAT GTC ACG CAC GAT-3，扩增片段长度为250bp，引物由上海生工合成。PCR产物用1.8%琼脂糖凝胶分析。1.2.6 Western blotting检查磷酸化p38表达：用0.01M PBS冲洗

8、培养融合至80%的细胞，加入450l裂解液（1mM NaHCO3和10mM PMSF）后用细胞刮将细胞刮下收集到EP管中，15，000rpm离心，收集上清蛋白样品，用BCA ProteinAssay Kit（美国Pierce公司）对每种蛋白样品定量。每种样品取20g进行变性蛋白电泳，凝胶浓度为12%。电泳结束后将凝胶中蛋白转到硝酸纤维素膜上（美国Millipore公司），5%脱脂奶粉封闭过夜后，将硝酸纤维素膜放入一抗室温孵育1h。洗膜后，将膜与HRP-结合的二抗室温孵育1h。洗膜后用ECL Westernblotting system（美国GE公司）显色。1.2.7 统计学处理：数据资料以均数

9、±标准差（x±s）表示，并用SPSS软件16.0进行t检验或单因素方差分析。2 结果    2.1 Claudin-6诱导MCF-7细胞凋亡 为了检测claudin-6是否能够诱发MCF-7细胞凋亡，应用TUNEL法、DAPI stain和Annexin-V/PI double stain检测各组细胞凋亡情况。结果显示，实验组细胞的凋亡率与vector组比较明显增高。同时DAPI核染色发现在稳定表达claudin-6的实验组细胞中可见明显的凋亡细胞核形态，即细胞核呈波纹状，染色质高度凝聚、边缘化，部分细胞核裂解为碎块。而control

10、组细胞的自然凋亡率与vector组比较，差异无显著性意义，结果如图4所示。上述结果说明，claudin-6促进了MCF-7细胞凋亡。2.2 Claudin-6刺激MCF-7细胞信号转导途径的激活 ERK、p38 MAPK和PI3KMAPK等信号途径在细胞凋亡诱导中发挥了重要作用。 在claudin-6表达的MCF-7细胞中，claudin-6是否激活这些信号转导途径，从而参与细胞凋亡的调控？应用Western blot检测各组细胞中上述信号途径的激活情况。结果发现，在claudin-6表达的MCF-7细胞中p38 MAPK途径明显处于激活状态，如图5、6所示。上述结果提示claudin-6表达

11、激活了p38 MAPK途径。2.3 抑制剂对不同信号途径的抑制作用 为进一步明确p38 MAPK信号途径在claudin-6介导信号转导通路中的作用，我们应用该信号途径特异性抑制剂，观察其是否能选择性阻断相应的信号途径：p38 MAPK抑制剂SB203508。应用Western blot检测p38 MAPK信号途径活化状态，结果如图7-12所示。结果发现p38 MAPK途径的确能够被特异性抑制剂SB203580明显抑制，而claudin-6的表达未受影响。2.4 p38 MAPK信号途径在表达claudin-6的MCF-7细胞中凋亡调控的作用 为明确p38 MAPK途径在claudin-6诱导

12、MCF-7细胞凋亡中的作用，我们用SB203580处理各组细胞，然后应用Western blot检测各组细胞的凋亡情况。结果发现用SB203580阻断p38MAPK途径后，实验组细胞claudin-6的促凋亡作用被抑制，出现细胞凋亡降低，如图13、14所示。上述结果表明，MCF-7细胞中claudin-6的促凋亡作用是通过p38 MAPK途径转导的。3 讨论    Claudins 是构成细胞紧密连接的一类重要的跨膜蛋白，其表达和定位对于紧密连接结构和功能的完整性都非常重要。Claudin-6 是 claudins 家族成员之一。近来的研究表明 clau

13、dins 表达改变与上皮来源的肿瘤发生及转移有关。在某些特定上皮来源肿瘤中 claudins 表达异常，例如 claudin-1 表达下调或claudin-3 和-4 上调能够增加肿瘤细胞的侵袭性，促进瘤细胞的恶性转化。临床上，某些claudins 表达异常是判断侵袭性肿瘤预后的重要指标。因此，确定claudins 在肿瘤发病中的作用能够为我们更深入的了解肿瘤发生及恶变的机制提供帮助。我们在前期的研究工作中克隆和鉴定了肿瘤抑制相关基因claudin-6，建立了稳定转染claudin-6真核表达载体的MCF-7细胞单克隆，发现细胞表达claudin-6后生物学行为发生了很大改变，比较突出的变化就

14、是细胞生长缓慢并且出现了明显的死亡，为验证这种死亡部分是由于细胞凋亡造成的我们对转染前后的细胞进行了凋亡的检测并比较，结果发现与对照组相比，claudin-6表达细胞出现了明显的凋亡现象。细胞凋亡是一个非常复杂的生理过程，对于有机体维持稳态至关重要，凋亡的缺失常常是肿瘤发生的原因之一。许多因素都可以诱发细胞凋亡，而不同诱导因素可经不同途径诱导细胞凋亡，同一种诱导因素在不同条件下的作用机制也不尽相同。因此，我们推测 MCF-7 细胞中 claudin-6 表达的缺失导致细胞逃避了凋亡，并且在癌变过程中发挥了一定的作用。而且，Makoto 等人发现MCF-7细胞中 claudin-6基因表达沉默使

15、细胞对凋亡诱导剂的敏感性降低。此外该研究组证明抑制 occludin 能导致细胞对致凋亡因素的抵抗性增加以及能逃逸细胞老化程序，因此增强了癌细胞的致癌、侵袭及转移能力。目前关于claudins诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究甚少，因此本研究为探讨claudins促瘤细胞凋亡的调控机理提供了线索。本文报道了在MCF-7细胞系中，claudin-6表达上调能明显促进细胞凋亡，从而达到抑瘤作用。凋亡在防止癌症的发生和维持阻止稳态中发挥了重要的作用。越来越多的研究发现凋亡活性的缺失促进了肿瘤的发展。因此，更好理解claudin-6表达缺失诱导的细胞凋亡在肿瘤发生中发挥了关键的作用。 此外，claudin-6

16、的表达也降低了癌细胞的恶性表型，如侵袭和迁移活性，从而抑制了肿瘤的转移。接着我们对claudin-6诱导细胞凋亡的信号通路进行了检测。至今，关于claudins参与的信号通路研究甚少，但是发现其与一些信号通路有关。如Taddei等人发现发现在鼠胚胎干细胞中claudin-5表达上调时PI(3)KAkt pathway途经被激活。Kun Zhang等人发现在乳腺癌细胞系T47D中claudin-1表达下调能够激活Erk1/2途经，从而导致细胞的运动性增加。此外，Oshima等人发现应用阿司匹林处理人类胃癌细胞系MKN28能通过claudin-7激活p38 MAPK途径，降低单层培养细胞的跨上皮电

17、阻，提高跨上皮的渗透性。因此，我们检测了细胞在转染claudin-6前后上述通路的活化状态， 同时应用各通路抑制剂进一步确定上述通路在claudin-6诱导凋亡中的作用。结果发现，与对照组相比p38 MAPK途径在claudin-6表达细胞中处于高度活性状态，而被检的其它信号蛋白磷酸化Erk1/2和Akt在各组间没有明显差别。随后我们应用通路特异性抑制剂进一步验证了假设。结果表明应用通路特异性抑制剂后磷酸化的p38明显减少，而其它被检的信号蛋白改变不明显。p38 MAPK途径主要参与细胞应激反应和炎症反应，还参与细胞增殖、凋亡和分化。近来研究发现，p38 MAPK在细胞凋亡过程中起重要作用。研

18、究发现不同细胞在受到不同刺激影响时，p38 MAPK所扮演的角色是完全不同的。一些研究者发现p38 MAPK途径活化通过介导caspase激活或p53磷酸化诱导凋亡p38 MAPK参与细胞凋亡过程，与诱导bax转位；介导caspase的活化；p53磷酸化及增强TNF的表达介导的凋亡有关。但也有研究表明，p38MAPK信号通路也通过抑制前凋亡信号的产生，参与介导细胞存活信号通路而抑制细胞凋亡。在本研究中，p38在claudin-6表达的MCF-7细胞中明显处于活化状态，加入抑制剂后可明显抑制其活化。因此，我们假设应用通路特异性抑制剂也能影响到claudin-6介导的细胞凋亡和转移表型。为验证这一假设，我们检测了应用p38通路特异性抑制剂前后细胞的凋亡、侵袭和迁移活性。结果表明，与对照组相比，claudin-6表达克隆C2的细胞凋亡明显降低（Fig.3A right，C2），克隆C1的细胞凋亡率也呈现出降低的趋势。我们的结果表明，表达claudin-6的MCF-7细胞凋亡部分是由p38 MAPK途径介导的。此外，我们发现当p38途径受到抑制时，claudin-6表达的MCF-7的侵袭和迁移活性增高。众所周知侵袭和迁移活性能够反映肿瘤细胞的转移能力。因此，我们的结果表明c