永川豆豉胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其降糖活性研究(1)

1、永川豆豉胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其降糖活性研究(1)作者：郭瑞华， 王和平， 刘正猛， 翟丽， 吴少杰， 段姣姣，王宝【关键词】 豆豉；,胰蛋白酶抑制剂；,分离纯化；,降糖作用摘要：目的从豆豉中提取胰蛋白酶抑制剂，并探讨其降血糖活性。方法以永川豆豉为材料，经脱脂，酸性溶液提取，硫酸铵沉淀得到胰蛋白酶抑制剂粗提物，再经Sephadex G-75凝胶层析得到纯化的胰蛋白酶抑制剂，以纯化的胰蛋白酶抑制剂给糖尿病小鼠灌胃并观察其降血糖活性。结果从豆豉里分离出的胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制率为30%40%；用抑制剂提取液给四氧嘧啶糖尿病模型小鼠连续灌胃4 d，发现其血糖值明显低于模型组；观察小鼠的胰

2、组织病理切片，与糖尿病小鼠比较，灌胃后的小鼠胰组织明显得到修复。结论 豆豉提取液有较明显的降糖作用。关键词：豆豉； 胰蛋白酶抑制剂； 分离纯化； 降糖作用Purification A Trypsin Inhibitor from Lobster Sauce Produced in Yongchuan and Hypoglycemic Action of ResearchAbstract：ObjectiveTo isolate and purify the trypsin inhibitor from Lobster sauce and investigate its hypoglycemic

3、action.MethodsA trypsin inhibitor was purified from the lobster sauce of Yong Chuan by defatting，extraction with axidic buffer，precipitation，chromatography on Sephadex G-75， and its hypoglycemic action in mice was studied.Results A series study on lobster sauce showed that the inhibitor had inhibiti

4、on activity of thirtyforty percent to trypsin. In mesoxalyl carbamide model，the blood glucose levels were reduced after four days treated with lobster sauce extracts of Yong Chuan, compared with the model group.ConclusionThe trypsin inhibitor has hypoglycemic action.Key words：Lobster saace； Trypsin

5、inhibitor； Isolation and purification； Hypoglycemic action蛋白酶抑制剂广泛存在于动植物和微生物中，具有抑制蛋白酶的活性的作用，能与相应的蛋白酶水解，参与体内许多重要生理过程的调节。其中胰蛋白酶抑制剂具有重要的药用价值，对于急性胰腺炎、肺气肿、出血性和败血性休克等疾病有独特的疗效1。蛋白酶抑制剂被认为是植物天然的自我防御体系，是植物抗病基因工程的重要目的基因来源2。大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）与其它临床上广泛应用的胰蛋白酶抑制剂具有相似的性质，但其生理活性研究还没得到足够的重视。和其他胰蛋白酶抑制剂相比，大豆胰蛋白酶抑制剂具有分子量较小、

6、免疫反应较弱、植物来源的抑制剂能避免携带动物病毒、原料来源广、价格低廉等优点，应当得到足够的重视。大豆胰蛋白酶抑制剂的种类有710种，目前研究证明主要有两种在动植物体内能抑制胰蛋白酶活力：一种为鲍曼克抑制剂(BBI),是由71个氨基酸组成的多肽，分子量为7 975，分子内有7个二硫键，另一个为库尼兹抑制剂（KSTI），分子量约2万，分子内有2个二硫键。近年来国外报道发现低浓度的BBI在动物体内对直肠癌、肝癌等多种癌症有抑制作用；另有报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调可能有一定效果3，但未见有降血糖作用的详尽报道。因此，对具有强抗癌活性且毒性小的胰蛋白酶抑制剂，从豆豉中分

7、离纯化，使其成为抗癌、治疗糖尿病及其并发症的新药用于临床，有十分积极的意义。1 仪器与材料DS1高速组织捣碎机（上海标本模型厂）, KDC1042离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），722分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司），AE240电子天平（METTLER公司）；雄性昆明种小鼠（体重1822 g），永川豆豉(市售咸豆豉) ，透析袋，牛胰蛋白酶(1250) 、BAPNAHCl(购自上海维思科贸有限公司), Tris( 成都化学试剂厂生产)，sephadexG75 (上海化学试剂厂生产)，四氧嘧啶(Alloxan，Sigma公司)，葡萄糖试剂盒GLU（氧化酶法，液体，北京北化康泰临床试

8、剂有限公司），肝素钠（天津生物化学制药厂），其它试剂均为国产分析纯。2 方法与结果2.1 豆豉胰蛋白酶抑制剂的分离纯化2.1.1 豆豉胰蛋白酶抑制剂粗提物的制备大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法已由Kakade等人在1974年提出。由于大豆胰蛋白酶抑制剂对热酸环境相对稳定，一般采用水浸酸提、沉淀再经离子交换或凝胶层析纯化制得。取2 kg永川豆豉，于46恒温干燥9 h,干燥后置于干净托盘中,把干燥豆豉粉碎、称重，然后加入去离子水2 L，于0提取15 h。15 h后于3 000 r/min离心6 min,沉淀弃去, 收集上清液。取上清液，加入正己烷正己烷上清液(12)，静置30 min,后用1 000

9、ml的分液漏斗分离上述混合液,回收正己烷,收集棕色豆豉提取液。用稀盐酸20%(v/v)调豆豉提取液的pH约为4，于55水浴中保温1 h。称取固体硫酸铵，分次少量加入于水浴的上清液里，使硫酸铵的饱和度为30%，继续于55的水浴恒温15 min，离心15 min（3 800 r/min），弃去沉淀，留上清液。在上清液里加固体硫酸铵，使硫酸铵的饱和度为55%，55保温10 min，再离心15 min，弃去沉淀，收集上清液。再于上清液里加固体硫酸铵，使硫酸铵溶液的饱和度为70%，55恒温10 min，离心30 min（12 000 r/min），弃去上清液，收集沉淀，用20 ml磷酸盐缓冲液（pH 7

10、.8）溶解沉淀,沉淀即为抑制剂粗提物4，于4保存在冰箱里。2.1.2 抑制剂粗提物的透析将抑制剂粗提物置于透析袋中蒸馏水充分透析7 d，除去盐分。2.1.3 凝胶柱的制备及抑制剂粗提物的纯化5取层析柱（16 mm60 cm)洗干净并烘干。称取12.5 g sephadex G75溶解在250 ml 0.05 molL-1 pH 7.8的磷酸缓冲液中，充分混匀后，在100水浴中蒸煮5 h，赶走气泡，将凝胶连续沿壁缓缓倒入层析柱中，待有2 cm沉淀后，打开柱子下端的出口。稳定以后在凝胶的上缘留23 cm缓冲液，并放一个面积相当的滤纸片，吸出存留缓冲液，加入5 ml样品，连上缓冲液，打开出口阀，控制流速在2 ml/h。流出30 ml后，用干净的试管分部收集（23 ml），检测每管的抑制剂活性。2.1.4 BAPNA法测定胰蛋白酶抑制剂活性 参考文献6略加改进，取不同胰蛋白酶抑制剂制备物并与0.2 ml胰蛋白酶溶液（0.1mg/ml）混合，于5