接枝淀粉作为固定化酶载体研究进展(1)-

1、粮食与油脂2009年第1期 1接枝淀粉作为固定化酶载体研究进展冯涛1,顾正彪2,金征宇2,庄海宁2(1. 上海应用技术学院香料香精技术与工程学院,上海200235;2. 江南大学食品学院,江苏无锡214122摘要:该文综述接枝淀粉用作固定化酶载体应用情况,通过接枝不同类型单体,淀粉将具有不同理化性质。以接枝淀粉为固定化酶载体主要方法有:共价结合法、物理吸附法或包埋法;以接枝淀粉为载体固定化酶主要有:糖化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶、-淀粉酶、-胰凝乳蛋白酶和脲酶等。关键词:接枝淀粉;固定化酶;酶载体Review on grafted starch as immobilized enzyme

2、supporterFENG Tao 1,GU Zheng-biao 2,JIN Zheng-yu 2,ZHUANG Hai -ning 2(1. School of Perfume and Aroma Technology ,Shanghai Institute of Technology ,Shanghai 200235,China ;2. School of Food Science and Technology ,Jiangnan University ,Wuxi 214122,China Abstract :The situation of grafted starch used as

3、 immobilized enzyme supporter was reviewed in this paper.The starch would have different physical and chemical properties by grafting different kinds of the monomers. The main immobilization methods by using grafted starch as enzyme supporters were covalent bonding ,physical -adsorption and entrapme

4、nt. The enzymes immobilized by the grafted starchwere glucoamylase ,glucose isomerase ,glucose oxidase , -amylase ,-chymotrypsin and urease.Key words :grafted starch ;immobilized enzyme ;enzyme supporter 中图分类号:TS236.9 文献标识码:A 文章编号:10089578(200901000103收稿日期:2008-11-25作者简介:冯涛(1978,男,讲师,主要研究方向:天然香精香料在食

5、品中应用。接枝淀粉是一种淀粉分子链上含合成聚合物的淀粉衍生物,是淀粉经引发剂引发生成自由基后,再与具有不饱和键单体起连锁反应,接枝共聚形成一种新型合成物。其既有淀粉分子特性,又有合成高分子特性,并具有一定生物可降解性1。例如,淀粉与丙烯酸钠聚合制备淀粉-g -PAANa(聚丙烯酸钠,可作为一种吸水性很强的超强吸水剂2,被广泛应用于农业土壤保湿及卫生用品制造,其结构如图1所示。又如淀粉-g -PAN(聚丙烯腈,不仅可用作吸水剂,且还是一种性能优异生物材料3,既可用作药物缓释剂以提高药效,也可用作农药缓释剂,而减少环境污染。再如淀粉-g -PAM(聚丙烯酰胺用作纺织上浆料4,可代替传统对环境有害聚

6、乙烯醇,被称作“绿色浆料”。还有如淀粉-g -PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯可作为生物可降解塑料原料5。可见,根据淀粉接枝侧链不同,接枝淀粉相应具有不同用途。图1淀粉聚丙烯酸钠接枝共聚物结构模型图1 接枝淀粉用作固定化酶载体理想固定化载体材料应具有以下优点:化学性质稳定,具有亲水性,一定的刚性、机械稳定性,较大表面积及抗微生物侵染等6。接枝使淀粉具有一定亲水性,刚性和机械稳定性,由图1可看出,接枝淀粉呈树叉状,不仅有利于形成空间网络结构包埋酶或细胞等生物活性物质,也有利于增大表面积而增强物理吸附性能,淀粉分子骨架或接枝侧链上羟基等活性基团则可与某些双功能试剂发生酯化反应,通过共价结合方法固定酶或细

7、胞。例如淀粉-g -PMAA 中,一方面淀粉骨架上残留羟基可与连接酶分子“手臂”发生共价偶联反应;另一方面侧链上具有羧基基团,还可提供一定的质子,以调节固定化酶最适pH 值,提高酶活力,这一类接枝淀粉固定化酶原理类似于氨基酸共聚体等聚合物,称为共价结合法。再如淀粉-g -(PAN -PAM,具有较高吸水性,在制备成微球淀粉后,因其表面积增加,使物理吸附作用增大从而达到吸附酶分子目的,这一类接枝淀粉固定化酶方法类似于壳聚糖、纤维素等天然高分子,称为物理吸附法。还有如淀粉-g -PAN (聚丙烯腈,经酸水解后,能形成具有一定孔隙结构HSPAN,有利于酶分子嵌入,这一类接枝淀粉固定化酶方法称为包埋法

8、,与常用聚丙烯酰胺等相似。2 共价结合法共价键结合法是将酶与聚合物载体通过共价键粮食与油脂2 2009年第1期结合而固定化方法。其优点是酶与载体结合较为牢固,酶不易脱落;缺点是反应条件较为剧烈,酶活损失较大,且制备过程繁杂。2.1 重氮化反应我国独创使用对-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA作为双功能试剂,将一系列酶共价结合到多糖类载体上6,其原理如图2所示。葛玉斌、吴永革等采用反相悬浮聚合方法,将淀粉与甲基丙烯酸接枝共聚,得到粒度较均一多孔球状淀粉接技共聚物,以其为载体通过对-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA共价偶联固定化糖化酶,其结果为:固定化酶活力为1462 IU/g 干胶;蛋白载量为49.3 mg/

9、g 干胶;比活力为29.6 IU/g 蛋白。5.778。 图2接枝淀粉球以SESA 固定化酶9 葛玉斌、王树岩等以多孔球状淀粉接技共聚物为载体,以对-硫酸酯乙砜基苯胺为载体活化剂,采用重氮化法共价偶联共固定糖化酶和葡萄糖异构酶。该共固定双酶体系适于各种类型淀粉底物,在pH 6.0,60条件下,共固定双酶体系能将5%(质量浓度DE -27糊精一步转化为果糖含量为20%的果葡糖浆,其催化效率为天然酶体系1.6倍。2.2 接枝共聚反应意大利Angiuro 等以甲基丙烯酸缩水基甘油酯作为双功能试剂,通过环氧基开环反应与酶分子结合,制备含烯烃基酶,继而在引发剂作用下,与淀粉分子上羟基和烯类单体发生自由基

10、聚合反应,形成酶淀粉接枝共聚物,反应过程如图3所示。通过此法固定化酶主要有:葡萄糖氧化酶、-淀粉酶和-胰凝乳蛋白酶。这种固定化酶优点在于酶蛋白分子与载体通过一定长度接枝链连接起来,这样可减少酶与载体紧密接触而带来失活现象,同时也可降低酶和底物扩散限制效应1112;缺点是固定上的酶数量少,成本高,很难应用于工业生产中。3 物理吸附法陈尊,孔维等合成淀粉接枝丙烯腈及丙烯酰胺两亲性高分子化合物,并以此为载体,用物理吸附方法固定化糖化酶。对固定条件研究表明,缓冲液浓度,pH 值及吸附时间和加酶量都对固定化酶活力、比活有一定影响。在最适固定化条件下,固定化酶活力为1500 U/g 干胶,蛋白载量为25

11、mg/g 干胶,比活为60 U/mg 蛋白,比天然酶比活(8.0 U/mg 蛋白提高6倍。最适反应温度比天然酶提高10(天然酶最适反应温度为50。无底物存在下,固定化酶在55半衰期为24 h,而天然酶只有l h;有底物存在下,固定化酶在55半衰期为220 h,45操作半衰期由外推法算为69天,且该载体对糖化酶有一定保护作用。当固定化酶在低于55热处理一段时间后,对酶活力有激活作用,酶活力最大可提高40%。该载体合成简便,固定化方法简单,步骤少,因而为在工业上应用提供一种新的可能性13。4 包埋法包埋法是将酶包埋于格子(Lattice内,此格子结构可防止酶分子渗出,但底物仍能渗入这格子内与酶相接

12、触,酶分子本身不参加水不溶性格子形成,许多种酶都可用此法固定化,如图4所示。图4包埋法包埋酶分子示意图144.1 凝胶包埋法美国农业研究协会北方研究中心Slininger 等在Starch-O CH 2 CH (CH 2 CHn CH 2 CC O CH 2 CH CH 2 NH EnzymeFe 2+H 2O 2C O CH 2 CH CH 2 NH Enzyme C O CH 2 CH CH 2NH 2 Enzyme + Starch-OH + CH 2 $C O CH 2 CH CH 2 + NH 2 Enzyme CH 2 CCH 3O CH 3OCH 2 C CH 3O CH 2 C

13、CH 3O OH OH OH R R R (vinyl-enzyme(vinyl-monomer(Enzyme-grafted starchO 图3通过接枝共聚反应固定化酶10粮食与油脂2009年第1期 3分析研究纤维素-g -PAN、淀粉-g -聚苯乙烯和淀粉-g -聚(N,N-二甲基丙烯酸和酸解淀粉-g -聚丙烯腈对糖化酶固定能力后,发现酸解淀粉-g -聚丙烯腈固定能力最高。进一步通过SEM 观察其形态特征发现,酸解玉米淀粉-g -PAN 颗粒较小(直径15 m,无扩散阻滞效应,是最佳糖化酶载体。在最佳酸解淀粉-g -PAN 组成条件(2%淀粉98%聚丙烯腈,w/w下,游离酶和固定化酶具有

14、相似Km 值、最适温度和pH,每克固定化酶每小时可生成葡萄糖1.12.7g,其半衰期为1,800 h,最适温度为50,最适pH 为4。淀粉-g -PAN 易于制备,无须交联剂如戊二醛等,因此,是一种很有前景的固定化糖化酶载体16。4.2 辐射包埋法酶溶解在纯单体水溶液、单体加聚合物水溶液或纯聚合物溶液中,在常温或低温下,用-射线、-射线或电子束进行幅照,可得到包埋有酶的亲水凝胶。酶主要分布在载体表面层区域6,如图5 所示。图5水凝胶微球表面酶分子状态16越南胡志明大学Nguyen anh Dung 等将玉米淀粉用含有0.01 M Cu 2+丙烯酰胺水溶液轻微溶胀后,再用60Co 辐射,合成一种

15、亲水性凝胶用于固定化脲酶。脲酶可通过粘附方法固定在接枝淀粉上。结果表明,以0.50 Mrad0.75 Mrad 剂量幅射合成接枝淀粉接枝率最高,且接枝率随辐射速率增加而递减。经实验,确定以辐射剂量0.5 Mrad 和15%丙烯酰胺单体作为固定化脲酶的聚丙烯酰胺接枝淀粉最优制备条件。将固定化好的脲酶经7个批次反应后,其活力回收率仍能保留为原来游离酶60%17。5 结束语以接枝淀粉作为载体固定化酶研究主要集中在上世纪80年代到90年代,固定酶也仅仅只有糖化酶、脲酶和葡萄糖异构酶几种。但接枝淀粉通过与不同烯类(vinyl单体聚合可得到性能各异共聚物。按带电情况来分,有阳离子、阴离子、中性接枝淀粉;按

16、亲水情况来分,有亲水型、疏水型和两亲型接枝淀粉;按聚合形态来分,有接枝淀粉凝胶、微球和膜。根据这些特性,匹配相应酶,按吸附、包埋、共价键结合或交联方法进行固定,可得到酶活较高,稳定性很好固定化酶。参考文献 1 Ranby B. New methods for graft copolymerization onto celluloseand starch,A. Modified cellulosics C. Academic Press,1978. 171. 2 林本农. 新型高分子材料淀粉接枝共聚物超强吸水剂的研究J. 中国粮油学报,1995,10(3:3946. 3 Shimona Gere

17、sh,Ygal gilboa,Julia Peisahov -korol. Preparationand characterization of bioadhesive grafted starch copolymers as platforms for controlled drug delievery J. Journal of Applied Polymer Science,2002,86:11571162. 4 周永元,祝枝峰.一类新型浆料接枝变性淀粉J. 中国纺织大学学报,1997,23(4:815. 5 Jrgen Lrcks. Properties and application

18、s of compostable starch -based plastic material J. Polymer Degradation and Stability,1998,59:245249. 6 陈陶声,居乃琥,陈石根. 固定化酶理论与应用M. 北京:轻工业出版社,1987. 109145. 7 葛玉斌,吴永革,孙文田,等. 多孔球状接枝共聚物的合成及其性质研究J. 高等学校化学学报,1997,18(6:978980. 8 吴永革,葛玉斌,孙文田,等. 酸性接枝淀粉固定化糖化酶及稳定性研究J. 高等学校化学学报,1998,19(8:13461348. 9 蒋中华,张津辉. 生物分子固

19、定化技术及应用M. 北京:科学技术出版社,2001. 97.10Angiuro L D,Cremonesi P, Mazzola G,et al. Preparationand characterization of enzymes immobilized by graft copolymerization to different polysaccharides J. Biotechnologyand Bioengineering,1980,22:22512272.11D'Angiuro L, Vecchio G,Mazzola G. Bisacryloylpiperazineas

20、vinylating agent for enzyme immobilization by graft -copolymerization onto polysaccharides J. Angewandte Makromolekulare Chemie,1981,104(1:129143.12D'Angiuro L,Cremonesi P,Cantafi R. Enzyme immobilizationon polyglycidylmethacrylate graft -copolymer of different polysaccharides J. Angewandte Makromolekulare Chemie,1980,91(1:161178.13陈尊,孔维,周惠,等. 接枝淀粉载体固定化糖化酶的研究J.生物化学杂志,1995,11(2