丙型肝炎病毒NS5A蛋白功能的研究进展

1、丙型肝炎病毒NS5A蛋白功能的研究进展                     作者：周友乾，尹凤鸣 冯经华【关键词】  丙型肝炎 病毒NS5A 蛋白丙型肝炎病毒(HCV)可引起肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝脏疾病，且慢性化几率较高。目前全世界HCV感染人数仍呈增加趋势，因此科学家对HCV的研究高度重视。HCV有一个大的开放阅读框编码约三千多个氨基酸的多聚蛋白，经蛋白酶裂解为十个多肽片段;

2、氨基末端为结构蛋白包括有核心蛋白、包膜蛋白E1和E2、P7蛋白;羧基末端为非结构蛋白包括有NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白。基中NS5A蛋白位于HCV多聚蛋白前体的1973-2419氨基酸区域，由447个氨基酸组成，氨基末端为双亲性螺旋可与内质网膜结合。NS5A还包含有3个同样的ProXaaXaaPro基序，这些基序存在于许多信号蛋白中形成伸展的螺旋，并与Src同源3(SH3)功能区结合。根据NS5A上丝氨酸残基磷酸化程度的不同有p56和p58两种成熟形式。越来越多的科学家推测NS5A蛋白可能在HCV干扰宿主细胞内信号和免疫逃避方面有一定的作用，发表了不少论文。本文就

3、NS5A蛋白功能和作用机制的研究进展作一综述。1 与病毒复制的关系Lohmann等1最早运用亚基因组复制子系统研究提出NS5A与RNA复制有关。随后研究进一步发现NS5A的双亲性膜靶标螺旋的变异与复制子有关，导入三个螺旋分裂的突变可完全终止复制子建立G418耐药的克隆，意味着NS5A的膜结合是HCVRNA复制不可缺少的一步。体外临时转染细胞研究显示NS5A和NS5B结合是由NS5A的105-162和277-334残基与NS5B上的四个不连续的区域相结合。奇怪的是当他们的比例为0.1或更低时，NS5A可适度刺激NS5B的聚合酶活性，而更高的比例时NS5A抑制NS5B的聚合酶活性。具体机制目前还不

4、清楚，分析认为有可能是体外纯化的NS5A和NS5B融合蛋白的作用结果并不能准确地反映他们在体内的情况。Shimakami等删除NS5A中与NS5B结合的部分导致亚基因组复制子无功能，而如果删除部分不影响NS5A与NS5B结合则复制子仍能复制，因此推测NS5A与NS5B之间的相互作用是HCV RNA复制所必需的。用人类肝细胞cDNA文库的酵母双杂交筛选法研究细胞蛋白与NS5A蛋白的相互作用鉴定出33kD人类囊相关膜蛋白(hVAP-33)。体外连接及体内联合免疫沉淀作用研究，证实NS5A与hVAP-33之间有相互作用，病毒RNA依赖的RNA聚合酶NS5B也与hVAP-33作用，它俩分别结合到hVA

5、P-33的羧基末端和氨基末端，NS5A和NS5B同时与hVAP独立作用。免疫荧光显示，hVAP-33主要与ER、高尔基复合体、以及前溶酶体结合。hVAP可以作为HCV复制复合物的膜受体，介导HCV复制复合物与膜结合，NS5A及NS5B与hVAP-33的相互作用可能会影响宿主细胞的囊泡转运功能。研究还发现在一些HCV分离株中有一被称为干扰素敏感决定区(ISDR)内的突变率与病毒RNA滴度成负相关，在人肝细胞内NS5A的表达可活化内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)活性，而ISDR突变则破坏IRES活性，这也预示着NS5A蛋白可能在调节HCV复

6、制中起作用。最近Okamoto等发现NS5A在细胞质中与FK506结合蛋白8的相互作用也在HCV复制中发挥重要作用。2 与干扰素抗病毒治疗的关系Enomoto等通过分子流行病学调查发现NS5A与干扰素(IFN)治疗的疗效相关，并鉴定出NS5A中一个约40个氨基酸的序列在IFN耐药种株中相对保守，而在IFN敏感种株中变异率较高，因此，推测NS5A在IFN耐药中发挥一定的作用，并把这个氨基酸序列区称为ISDR。随后科学家10还发现：表达有IFN耐药的HCV1b种株的NS5A蛋白的细胞对IFN部分耐药，并允许脑心肌炎病毒和口腔炎小疱疹病毒生长;而在同样的实验中表达IFN敏感的HCV1a或HCV2a基

7、因型或者删除了ISDR的HCV1b型的NS5A蛋白并不能抑制IFN的活性。Nousbaum等11认为NS5A羧基末端ISDR以外的一段序列也与IFN活性有关。IFN是由宿主不同类型的细胞为应对病毒感染和某些刺激而分泌的细胞因子，分为型和型。型IFN(，)是由各类细胞针对病毒感染分泌的抗病毒活性多肽，表现出非特异性免疫应答特点;型IFN也称为IFN是由促有丝分裂素或抗原刺激激活的T细胞和巨噬细胞分泌的抗病毒多肽，充当特异性抗原免疫应答的任务。型IFN信号途径的传递始于IFN与特异性细胞表面IFN受体的结合。IFN与细胞膜上受体结合，引起受体二聚体化，受体胞内区的酪氨酸残基在Janus激酶作用下磷

8、酸化，而后信号传递体和转录激活剂(STATS)也被Janus激酶磷酸化。两种Janus激酶酶家族成员JAK1和Tyk2，参与了型IFN信号传导。磷酸化的STAT1和STAT2结合成异二聚体，转移到细胞核内与DNA结合蛋白p48结合，形成三聚体的干扰素激活基因因子3(ISGF3)。ISGF3在许多IFN激活基因启动区与IFN激活顺式作用元件(ISRE)结合促进转录。除了ISGF3外，不同的STAT和二聚体以及不同的IFN转录调节因子，在IFN信号传递途径中也起重要作用。大量IFN激活基因表达，其蛋白产物介导IFN多效性抗病毒作用。目前认为IFN抗RNA病毒的主要机制是其能够诱导产生的一种dsRN

9、A依赖的蛋白激酶(PKR)，这种PKR在RNA病毒基因复制时与dsRNA结合而激活，激活后能够磷酸化翻译启始因子eIF-2a亚单位的51位丝氨酸残基，使磷酸化的eIF-2a无法参与蛋白多肽链的翻译过程，从而抑制病毒或细胞蛋白的合成，达到抗病毒的效果12。而研究发现NS5A中ISDR及与其相临的羧基末端的26个残基与PKR的一个二聚作用区域结合后能够抑制PKR自身的磷酸化和对其他外来物质的磷酸化从而抑制PKR活性。不过也有科学家13，14报道未能发现ISDR与IFN疗效的关系。Podevin等15虽然证实NS5A能够抑制IFN抗脑心肌炎病毒和口腔炎小疱疹病毒的活性，但不管是IFN敏感的还是不敏感

10、的NS5A在Huh7或HeLa细胞中都未观察到对PKR活性的影响，用共免疫沉淀和共免疫荧光方法也未检测到NS5A和PKR的相互作用。这提示NS5A可能还通过其他机制抑制IFN的抗病毒活性。Khabar等16发现白介素8(IL8)能够减弱IFN的抗病毒活性，提示内源性的IL8的产生有助于病毒的感染。Polyak等17也发现HCV感染的患者血清中IL8的水平高于对照组，IFN无应答组高于应答组，并提出NS5A能够促进IL8的产生并减弱IFN的抗病毒活性。随后Girard等18用芯片分析法观察到了同样的现象。Blindenbacher等19发现表达有HCV全基因组的转基因小鼠IFN刺激转录因子ISG

11、F3的DNA结合活性降低，而淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒易感性增加。Shuai等20认为Stats的丝氨酸磷酸化在IFN信号的调节方面起着关键性的作用。Macdonald等21推测NS5A可能通过与连接蛋白Grb2相互作用抑制细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)MAPK的活性;这样，NS5A可降低Stat1丝氨酸的磷酸化并减弱细胞对IFN的反应。然而，他们22随后发现对IFN敏感和耐药的HCV不同基因型的NS5A都能与Grb2结合，似乎并不支持这个假说。3 与促进宿主细胞有丝分裂的关系HCV能够通过调节宿主细胞的有丝分裂信号途

12、径来调节宿主细胞的生长和活性，从而维持其慢性感染状态。目前认为主要有三种途径：ERK途径、SAPK/JNK途径和p38MAPK途径23。他们都是基于一个包含有MAPK的三重激酶信号组件，NS5A能够调节这三种MAPK信号途径。NS5A能够抑制ERK MAPK途径：体外研究显示NS5A能够与Grb2结合。Grb2能够通过一个SH2区与活化的EGF受体上磷酸化的酪氨酸残基结合使鸟嘌呤核苷酸交换因子Sos迁移到细胞膜，然后催化Ras GDP-GTP转换，并激活ERK途径22。Tan等24报道NS5A并不阻止Grb2-Sos复合体的形成，而后Hanafusa等进一步证实NS5A能与Grb2 SH2区结

13、合抑制Grb2-Sos与生长因子受体结合，并未抑制Grb2-Sos的结合。NS5A能够活化JNK MAPK信号途径：NS5A与连接蛋白TRAF2结合，再与配体上的TNF受体结合，参与JNK的活化25。Park等26认为NS5A不是直接活化JNK，仅仅是通过TNF增强其活性。NS5A还可通过与TRAF2相互作用调节JNK的活性，在缺乏TNF时，NS5A也能够通过足够表达TRAF2调节JNK的活性。NS5A也能够抑制EGF刺激的p38MAPK的活性：这条途径在通过下游靶标控制蛋白翻译方面起着关键性的作用，主要是磷酸化翻译启始因子eIF4E和调节其活性。NS5A的表达能够降低eIF4E的磷酸化27。

14、4 与细胞凋亡的关系NS5A能够利用多种机制抑制外源性和内源性凋亡刺激因子减少宿主细胞的凋亡。TNF是一种主要的外源性凋亡刺激因子，研究表明28，29表达NS5A蛋白的细胞能够抵挡TNF的作用，与对照组相比细胞凋亡明显减少。生物化学分析显示NS5A与TNF应答连接蛋白TRADD相互作用调节抑制TNF-信号。TRADD与配体上活化的TNF受体结合并形成一个复合体，这个复合体再向多个下游的效应器(胱门蛋白酶、NF-B等)传达信号;NS5A与TRADD结合能够阻断这些信号。内源性的凋亡主要通过促凋亡和抗凋亡信号的平衡来调节，例如Bcl2蛋白家族包含有促凋亡和抗凋亡成分，他们在线粒体和细胞核膜上受Bc

15、l-2相似区域(BH)间相互作用的驱动形成异二聚体。这家族中不同成分之间的平衡指导着凋亡反应30。Chung等31发现Bcl2家族抗凋亡成分的BH区域与ISDR序列具有相似性。NS5A内的BH区域能够和促凋亡的Bcl2蛋白(Bax)结合促进细胞凋亡，这需要NS5A和Bax都存在于细胞核内;然而，完整的NS5A只存在于细胞质内。目前认为是凋亡细胞中的caspase家族切割了NS5A全长蛋白致使其内部稳含的核定位信号暴露出来，从而使NS5A进入细胞核内发挥功能32。在DNA损伤或不正常复制时p53是一种内源性凋亡信号。Majumder等33发现NS5A在细胞浆中能与p53结合形成复合物，封闭了p5

16、3与其特异DNA序列的结合区域或使p53发生空间构形变化导致结合区域隐蔽起来，抑制p53与DNA序列结合，使p53的反式激活作用减退，从而影响了p53下游基因(p21等)的活化和表达。NS5A还能粘附于内质网膜并介导内质网的应激，产生应激后内质网释放钙离子34，后者被线粒体吸收使跨膜电位发生改变，导致线粒体内氧化活性产物(ROS)水平升高，进而介导NF-B和STAT3的激活和核转位;发挥它们调控基因转录的生物效应，抑制p53的功能及其介导的细胞凋亡作用。龚国忠等35也研究证实NS5A能减弱DNA损伤剂诱导的G1期阻滞并阻断S期停滞，推测这可能使细胞DNA受到损伤时不能得到及时有效的修复，细胞在

17、病理状态下继续增殖分化，最后导致细胞功能和表型改变，是HCV致肿瘤病变的细胞分子机制之一。最近Inubushi等36发现NS5A还可能通过抑制Syk激酶的活性而导致宿主肝细胞癌变。         【参考文献】  1Lohmann V, Korner F, Koch JO, et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell lineJ.Science, 1999, 285110-113.Elazar M,

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