ClC-3在糖尿病的表达及其变化

1、ClC-3在糖尿病的表达及其变化     你正在浏览的基础医学论文是ClC-3在糖尿病的表达及其变化            【摘要】 【目的】 在糖尿病发展的不同时期探讨容积依赖性氯通道蛋白-3(ClC-3)的表达及其变化。【方法】 用链脲佐菌素(STZ)诱导大鼠糖尿病模型后,在第2、4、8、12和16周,用蛋白印记法检测主动脉、肾脏(皮质、髓质)及脑组织上ClC-3蛋白的表达。【结果】 各组织上均检测到内源性ClC-3蛋白的表达,分子

2、量在80 KDa-110 KDa之间;与对照组相比,糖尿病时大鼠主动脉平滑肌及脑组织上ClC-3蛋白的表达在第8周后显着性升高(P< 0.05),肾髓质上ClC-3蛋白的表达显着性降低(P< 0.05),而肾皮质上ClC-3蛋白的表达未见显着性差异。 【结论】 除肾皮质外,在糖尿病第8周开始,ClC-3蛋白在主动脉平滑肌及脑组织上表达显着性增加,而肾髓质表达显着性降低。【关键词】 大鼠; 主动脉; 肾脏; 脑组织; 氯通道蛋白-3Abstract: 【Objective】 This study was designed to investigate the expression a

3、nd changes of ClC-3 protein under condition of diabeticrats. 【Methods】 Diabetic rats were induced by an injection of streptozotocin. At the different periods of diabetic duration (2 weeks, 4 weeks, 8 weeks, 12 weeks, and 16 weeks), the expression and changes of ClC-3 protein in thoracic aortic smoot

4、h muscle, the kidneys (cortex, medulla) and the brains were detected using Western blotting. 【Results】 ClC-3 protein endogenously expressed in thoracic aortic smooth muscle, kidney (cortex, medullar) and brain of rat, and its molecular weight was between 80 ku and 110 ku. Comparing with the control

5、group, the expression of ClC-3 was increased significantly in thoracic aortic smooth muscle and brain of diabetic rats from 8 weeks diabetic duration; however, it was decreased significantly in kidney medulla. There was no significant difference in expression of ClC-3 of kidney cortex between contro

6、l and diabetic rats. 【Conclusion】 The endogenous expression of ClC-3 protein is altered in different tissues with the development of diabetes, and it is increased in thoracic aortic smooth muscle and brain, but it is decreased in kidney medulla.Key words: rats; aortic; kidney; brain; chloride channe

7、l protein 3J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(6):613-616 糖尿病患者易并发高血压、动脉粥样硬化、阻塞性心衰及微循环功能障碍,后者进一步引发糖尿病肾病、视网膜病、神经合并症等,揭示糖尿病本质上也是一种心血管疾病。Cl-是细胞外液的主要阴离子,通过跨膜转运和阴离子通道蛋白参与多种生理功能,Cl-的跨膜转运形成Cl-电流,以前当作“漏电流”而被忽视。近年来有关Cl-通道的研究得到飞速发展,其中有关容积依赖性Cl-通道的研究成为了热点。研究发现容积依赖性Cl-通道主要由ClC-3基因编码1,2,当细胞处于低渗条件时通道开放,继而引起水与Cl

8、-共同转运出胞外,使细胞容积调节性减低。然而在糖尿病时,高血糖可引起血液渗透压改变,容积依赖性Cl-通道发生何种变化及其与合并症的产生是否有关是一个有趣的问题。本研究针对糖尿病时期大血管及微血管进行研究,观察ClC-3蛋白在不同时期大鼠主动脉平滑肌,肾脏及脑组织的表达及其变化。1 材料与方法1.1 实验材料和主要试剂正常雄性Wistar大鼠(由中山大学实验动物中心提供),体质量200250 g,100只。链脲佐菌素(STZ)、亮肽酶、抑肽酶、叠氮钠、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白(BSA)均为Sigma产品;硝酸纤维素膜为 Bio-Rad产品;ClC-3多克隆抗体为 Alomone Labs,Jer

9、usalem,Israel 产品;羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗为Cellsignaling产品;-actin 为Newmarker产品; 考马斯亮兰G-250 购自上海生工生物工程公司。1.2 糖尿病大鼠模型制作大鼠禁食12 h后一次性左下腹腔内注射由枸橼酸钠(0.1 mol/L,pH 4.5)配制的STZ 55 mg/kg诱导糖尿病模型。对照组注入等量溶剂。1周后尾静脉采血,用堡灵曼血糖仪(ReflouxR,Boehringer Mannheim,德国)检测血糖,以血糖大于16.7 mmol/L确定为糖尿病模型。分为糖尿病组和正常对照组,每组50只,每组随机分成5个时间点,即2,4,8,12和16

10、周,每个时间点10 只动物。1.3 组织裂解与蛋白质的提取取不同时期Wistar大鼠的胸主动脉,肾脏皮质,髓质以及脑组织分别放入预冷的PBS缓冲液中,去除动脉周围结缔组织及血块,用PBS冲洗3遍,加入3倍组织量的三去污剂裂解缓冲液,在冰浴下用组织匀浆器匀浆,将组织完全裂解呈乳状后, 4 , 3 000 × g,离心5 min,留取上清,再次4 , 12 000 × g,离心2 min,取上清,置于EP管中,放入-80 冰箱保存备用(可保存1周)。1.4 Western Blot考马斯亮兰法蛋白定量后,调整蛋白量,使每个加样孔中蛋白量相同。与5 ?滋L Marker(cell

11、signaling)一起进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕后凝胶上的蛋白电转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h,与 ClC-3多克隆抗体(1 2 000)和-actin抗体(1 1 000)孵育1 h,PBST洗脱1 h。硝酸纤维素膜与HRP-结合的二抗室温下共同孵育1 h,PBST洗脱1 h。ECL化学发光法显示结果。胶片用凝胶成像系统扫描分析灰度。1.5 统计分析结果均采用x±s表示,n代表动物数,同时期组间和同组的差异分别采用组间和配对t检验,检验标准取=0.05。2 结 果Wistar大鼠腹腔注射STZ建模成功后,糖尿病组出现明显的多饮、多食、多尿及生长迟缓等症状。糖

12、尿病组血糖(27.3 ± 2.3)mmol/L,明显高于正常组(5.2 ± 0.5)mmol/L;体质量(232 ± 26)g,明显低于正常组(277 ± 27)g;差异有统计学意义(P< 0.01), 整个实验期间糖尿病组血糖均高于正常组,体质重均低于正常组。2.1 ClC-3蛋白在大鼠主动脉平滑肌中的表达糖尿病大鼠主动脉平滑肌上ClC-3蛋白的表达升高,在第8周和12周时表达与对照组有显着性差异(P< 0.05,图1)。2.2 ClC-3蛋白在大鼠肾脏皮质中的表达糖尿病大鼠肾脏皮质上ClC-3蛋白的表达在第2周到12周时有升高的趋势,在第

13、16周时有降低的趋势,但未见统计学差异(图2)。2.3 ClC-3蛋白在大鼠肾脏髓质中的表达糖尿病大鼠髓质上ClC-3蛋白的表达在第2周到16周时有降低的趋势,在第12周和16周时与对照组相比有显着性差异(P< 0.05, 图3)。2.4 ClC-3蛋白在大鼠脑组织中的表达糖尿病大鼠脑组织上ClC-3蛋白的表达升高,在第12周和16周时表达与对照组有显着性差异(P< 0.05, 图4)。3 讨 论糖尿病可引起体内各系统的合并症。 大量研究表明与合并症产生有关的主要是由高血糖引起的:非酶类糖化过程、氧化还原应激、醛糖还原酶激活和二酰基甘油(DAG)-蛋白激酶C(PKC)通路激活这四大

14、因素 。Cl-是细胞外液中最为丰富的阴离子,氯通道普遍存在于真核细胞的细胞膜和细胞器膜。细胞容积的稳态十分重要,细胞内外渗透压变化、细胞生长分裂等可引起细胞容积发生改变,而在细胞容积调节中Cl-通道起重要作用。多项研究提示ClC-3蛋白是容积激活(volume-activated)Cl-通道,参与许多生理功能。编码ClC-3蛋白的基因已从大鼠肾3、小鼠肝、人胎脑4、豚鼠心脏5等组织克隆。有研究表明细胞内PKC是ClC-3通道的内源性抑制剂,PKC抑制作用的去除与低渗引起的通道开放密切相关6。本实验结果表明糖尿病大鼠主动脉平滑肌,肾脏皮质及脑组织上ClC-3蛋白的表达在糖尿病不同时期基本均升高,

15、与糖尿病时PKC活性增强,而PKC又可以抑制容积调节性Cl-通道的表达的推测不符。其可能原因是:与氧化应激有关。有研究表明在糖尿病大鼠眼睛白内障发生的过程中,其晶状体皮质纤维细胞中ClC-3蛋白及mRNA 的表达升高,用抗氧化剂干预后可使其降低7。同时由氧化应激诱导上升的ClC-3表达具有保护细胞凋亡的作用8,9。与炎性因子有关。有研究显示炎性因子可刺激ClC-3的表达增加10。在糖尿病中高血糖可促进多种血管活性物质和细胞因子的表达,如Ang、ET-1、NO、NOS、VEGF和TNF-等11。与离子通道重构有关。有研究表明在腹主动脉狭窄的动物模型中,在狭窄术后早期,ClC-3蛋白的mRNA的表

16、达升高,血压降低可以保护心肌离子通道的重构而不使ClC-3的表达增加。糖尿病大鼠肾脏髓质中ClC-3蛋白的表达下降,可能原因是:血管通透性的增加。糖尿病肾小球高滤过是早期DN的一个重要特征。肾脏髓质的生理功能主要是重吸收,高滤过及蛋白尿导致髓质重吸收功能下降。而Cl-通道是重吸收机制中的重要离子通道组成部分之一。与糖基化反应有关。在糖尿病中普遍存在糖基化反应,细胞外糖基化终末产物可能干扰细胞黏附和细胞间反应,细胞内糖基化终末产物能够改变蛋白转运和功能。高糖作为糖尿病合并症产生的始动因素引起体内糖基化产物生成,氧化应激增加,多种血管活性物质及炎性因子产生,血流动   你正在浏

17、览的基础医学论文是ClC-3在糖尿病的表达及其变化            力学改变等一系列变化12。在糖尿病过程中ClC-3蛋白受以上因素影响,表达发生变化,至于ClC-3蛋白改变是加重并发症的产生,还是一种保护性变化,还有待我们进一步探讨。总之,本研究结果表明,容积激活的Cl-通道在糖尿病的不同组织发生了不同的变化,可能参与了糖尿病合并症的产生。【参考文献】DUAN D, WLNTER C, COWLEY S, et al. Molecular identification

18、 of a volume-regulated chloride channel J. Nature, 1997, 390(6658): 417-421.FRANKE C, IAIZZO P A, HATT H, et al. Altered Na+ channel activity and reduce Cl- conductance cause hyperexcitability in recessive generalized myotonia (Becker) J. Muscle Nerve, 1991, 14(8): 762-770.IGARASHI T, GUNTHER W, SEK

19、INE T, et al. Functional characterization of renal chloride channel, CLCN5, mutations associated with Dents Japan disease J. Kidney Int, 1998, 54(6): 1850-1856.张晓东,臧益民,周士胜,等.心脏氯离子通道研究进展 J. 心脏杂志,2000,2(6): 473-477.JENTSCH T J, FRIEDRICH T, SCHRIEVER A, et al. The ClC chloride channel family J. Pfluge

20、rs Arch-Eur J Physiol, 1999, 437(6):783-795.DUAN D, COWLEY S, HOROWITZ B, et al. A serine residue in ClC-3 links phosphorylation-dephosphorylation to chloride channel regulation by cell volume J. J Gen Physiol, 1999, 113(1): 57-70.RAMANA K V, CHANDRA D, WILLS N K,et al. Oxidative stress-induced up-regulation of the chloride channel and Na+/Ca2+ exchanger during cataractogenesis in diab