FK506对肝移植受者T细胞亚群上CD152和PD1的调节研究

1、FK506对肝移植受者T细胞亚群上CD152和PD1的调节研究                   作者：李佳, 白杨娟, 王兰兰*, 卫红刚, 蔡蓓, 严律南, 吴泓【摘要】  目的: 动态观察肝移植受者外周血T细胞表面CTLA4/CD152和PD1的表达, 探讨FK506对负性协同刺激分子的调节作用。方法: 采用酶增强免疫分析法测定FK506的血药浓度。外周血T细胞亚群和T细胞表面CD152和PD1分子

2、的表达利用流式细胞术(FCM)进行检测。结果: 各时间组间FK506血药浓度无统计学意义(P>0.05)。随时间延长, CD4+T细胞持续下降, 至治疗3月时已明显低于健康对照组(P<0.05)。而各治疗组CD4+T细胞百分率均明显低于疾病对照组(P<0.05)。各时段治疗组CD8+T细胞均明显高于疾病对照组(P<0.05)。肝移植术后, CD4+和CD8+T细胞上CD152的表达较健康对照组升高(P<0.05), 治疗2周和1月组还高于疾病对照组(P<0.05)。治疗2月和3月组CD4+CD152+T细胞的表达较治疗2周和1月组下降(P<0.05)。

3、治疗3月组CD8+CD152+T细胞的表达较治疗2周和1月组降低(P<0.05)。术后T细胞亚群上PD1的表达有升高趋势。CD4+T细胞上PD1的表达在治疗2周开始明显高于健康对照组(P<0.05)。CD8+T细胞上PD1的表达从治疗1月时明显高于疾病对照组(P<0.05)。结论: FK506能上调T细胞表面负性协同刺激分子CD152和PD1的表达, 可能参与抑制效应T细胞的过度增殖与活化, 维持移植受者的存活和免疫稳态。 【关键词】  肝移植 CD152 PD 1 FK506Abstract  AIM: To dynamically observe th

4、e expression of CTLA4/CD152 and PD1 on T cell surface in the peripheral blood of liver allorecipients, and to explore the regulatory effect of FK506 on negative costimulatory molecules. METHODS: The blood concentration of FK506 was measured by enzymemultiplied immunoassay technique.  Flow cytom

5、etry (FCM) was used to determine the expression of T cell subsets and CD152, PD1 on T cell surface in the peripheral blood. RESULTS: There was no significant difference in blood concentration of FK506 between each group (P>0.05). With the progression of treatment, the frequency of CD4+T cells gra

6、dually decreased and was obviously lower than that in health control until the third month (P<0.05). The expression of CD4+T cells in each treatment group was significantly lower than that in disease control group (P<0.05). And the frequency of CD8+T cells in each treatment group was obviously

7、 higher than that in disease control group (P<0.05). After liver transplantation, the expression of CD152 on CD4+ and CD8+T cells was higher than that in health control group (P<0.05), and the expression in the second week and first month was higher than that in disease control group (P<0.0

8、5). The frequencies of CD4+CD152+T cells in the second and third month were lower than that in the second week and first month (P<0.05). The frequency of CD8+CD152+T cells in the third month was lower than that in the second week and first month (P<0.05). After liver transplantation, the expre

9、ssion of PD1 on T cell subsets had the tendency of advancing. Its expression on CD4+T cells was significantly higher than that in health control group from the second week (P<0.05), and the expression on CD8+T cells increased obviously from the first month compared with that in disease control gr

10、oup (P<0.05). CONCLUSION: FK506 could upregulate the expression of negative costimulatory molecules CD152 and PD1 on T cell surface and inhibit the proliferation and activation of effector T cells, which may contribute to maintain the survival and homeostasis of allorecipients.KeywordsLiver trans

11、plantation; CD152; PD1; FK506器官移植已经成为治疗终末期器官衰竭的有效手段, 但移植排斥反应是影响移植受者存活的重要原因。目前控制排斥反应较为有效的手段是使用免疫抑制剂。FK506（又名他克莫司或普乐可复）是一种针对T细胞的钙调磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitor, CNI), 它可以进入T淋巴细胞内与其特异的免疫结合蛋白FK506结合蛋白（FK506 bonding protein, FKBP）结合形成具有活性的FK506FKBP复合体, 后者抑制钙调磷酸酶的去磷酸活性, 从而抑制胞质中NFAT脱磷酸和核转位过程, 使与T细胞活化相关细胞因子的

12、基因转录受到抑制, 从而抑制受者T细胞的活化增殖1。而细胞因子等基因转录信号的强弱与细胞表面协同刺激分子的表达密切相关, 故器官移植后使用的免疫抑制剂对细胞表面协同刺激分子的调节作用就显得至关重要。我们拟通过对肝移植受者外周血T细胞亚群上CTLA4 (cytotoxic T lymphocyteassociated antigen4, 又称CD152)和PD1(programmed death1, 又称CD279)的表达进行分析, 旨在观察使用免疫抑制剂FK506后这些负性协同刺激分子的变化情况, 进一步阐明FK506对淋巴细胞活化通路的调节作用以及免疫抑制效应的作用靶位。1  材料

13、和方法1.1  材料  研究对象: 接受FK506治疗的肝移植受者组(简称治疗组), 均为2006-08/2007-04在四川大学华西肝移植中心接受同种异体肝移植的受者, 根据术后用药时间不同分为治疗2周组、 1月组、 2月组和3月组, 每组20例, 其中男性18例,  女性2例, 年龄2269岁。终末期肝脏疾病患者组(简称疾病对照组), 为拟进行肝移植的终末期肝脏疾病患者, 年龄2269岁, 男性17例, 女性1例, 共18例, 其中肝癌7例, 肝硬化10例, 重症肝炎1例。所有患者均未使用免疫抑制剂和相关免疫调节药物。健康对照组, 年龄2565岁, 男性16例

14、, 女性2例, 共18例, 均为健康志愿者, 无相关疾病, 均未使用免疫抑制剂和相关免疫调节药物。采集肝移植受者、 终末期肝脏疾病患者和健康志愿者肝素钠抗凝全血标本1份, 用于T细胞亚群及T细胞表面负性协同刺激分子CTLA4/CD152和PD1/CD279表达的测定。同时收集肝移植受者EDTA抗凝全血1份用于血药浓度检测。标本采集后2 h内进行处理及测定。    实验中所用的FACSCanto、 PerCpCD3/FITCCD4/PECD8三联鼠抗人单克隆抗体(mAb)、 PerCpIgG1/FITCIgG1/PEIgG1鼠抗人同型对照mAb为美国BD公司产品;

15、FITCCD4、 FITCCD8、 PECD152鼠抗人mAb、 PEIgG2a、 FITCIgG1鼠抗人同型对照mAb为法国Immunotech公司产品; Alexa Fluor 647PD1鼠抗人mAb、 Alexa Fluor 647IgG1鼠抗人同型对照mAb为美国ebioscience公司产品; 酶增强免疫分析仪Syva vTwin、 Emit 2000 Tacrolimus Assay为德国DADE BEHRING公司产品; RPMI1640培养基干粉购自Gibco公司; 佛波酯和离子霉素购自Sigma公司; 小牛血清购自武汉三利生物技术公司; NH4Cl溶血剂, 无菌磷酸盐缓冲液

16、(PBS, pH7.4)自配。1.2  方法1.2.1  细胞培养  用RPMI1640培养液按11体积比稀释采集的肝素钠抗凝全血并充分混匀, 而后加入佛波酯(终浓度10 g/L)和离子霉素(终浓度1 mg/L), 在50 mL/L CO2细胞培养箱中37培养4 h, 用于PD1分子的检测。1.2.2  检测方法  采用酶增强免疫分析仪对肝移植受者术后EDTA抗凝血进行FK506血药谷浓度测定。T细胞亚群的测定, 取肝素钠抗凝全血50 L加入10 L PerCpCD3/FITCCD4/PECD8三联抗体, 4下避光孵育30 min, 溶血并洗涤

17、后用FACSCanto检测, 并采用BD FACSDiva软件分析数据。T细胞表面CD152分子表达测定则取肝素钠抗凝全血50 L, 分别加入10 L FITCCD4 mAb或FITCCD8 mAb和PECD152 mAb, 4下避光孵育30 min, 溶血并洗涤后用FACSCanto检测。测定T细胞表面PD1分子的表达, 取培养后全血50 L并加入10 L PercpCD3/FITCCD4/PECD8三联抗体及Alexa Fluor 647PD1 mAb, 于4下避光孵育30 min后溶血, PBS洗涤重悬后用FACSCanto检测。1.2.3  统计学分析  采用SPS

18、S13.0统计软件对数据进行统计描述和分析, 首先进行正态性检验, 符合正态分布的数据用x±s表示, 2组间比较采用t检验, 多组间比较采用方差分析, 组间两两比较采用SNK法; 不符合正态分布的用中位数和4分位数间距表示, 2组间比较采用MannWhitney检验, 多组间比较采用KruskalWallis H检验, 组间两两比较采用Nemenyi法。P<0.05为有统计学意义。2  结果2.1  治疗组血药浓度分析  肝移植受者使用FK506进行抗排斥治疗的2周、 1月、 2月和3月末FK506平均血药谷浓度分别为(7.54±3.41

19、) g/L、 (8.02±4.01) g/L、 (6.21±2.62) g/L和(6.18±2.53) g/L。各时间组间FK506血药谷浓度无统计学意义(P>0.05)。在此期间无患者发生急性排斥反应。2.2  外周血T细胞亚群分析  CD3+T淋巴细胞在健康对照组、 疾病对照组和各治疗组间的表达均无统计学意义, 但T细胞亚群的表达有变化。疾病对照组CD4+T细胞的表达明显高于健康对照组(P<0.05), 而CD8+T细胞的表达明显低于健康对照组(P<0.05), CD4/CD8 T细胞比值明显高于健康对照组(P<0.

20、05)。肝移植术后随着治疗时间的延长, CD4+T细胞呈持续下降趋势。治疗2周、 1月和2月组CD4+T细胞与健康对照组水平相当(P>0.05), 至治疗3月时已明显低于健康对照组(P<0.05)。而不同时间段各治疗组CD4+T细胞百分率均明显低于疾病对照组(P<0.05)。各时段治疗组CD8+T细胞均明显高于疾病对照组(P<0.05), 也较健康对照组高, 但差异无统计学意义。随着治疗时间延长, CD4/CD8 T细胞比值不断降低, 从治疗1月起明显低于疾病对照组(P<0.05), 治疗3月时还明显低于健康对照组(P<0.05, 表1)。2.3 

21、 外周血T细胞亚群上CD152分子的表达分析  疾病对照组CD4+T细胞和CD8+T细胞上CD152分子的表达以及二者的比例均高于健康对照组(P<0.05)。肝移植术后经免疫抑制治疗, CD4+T细胞和CD8+T细胞上CD152的表达也较健康对照组升高(P<0.05), 治疗2周和1月组还高于疾病对照组(P<0.05)。CD4+CD152+T细胞从治疗2月和3月后的表达较治疗2周和1月组下降(P<0.05); CD8+CD152+T细胞治疗3月时的表达较治疗2周和1月组降低(P<0.05, 表2)。1     &#

22、160;   表1  外周血T细胞亚群分析（略）Tab 1  Analysis of T cell subsets in the peripheral bloodaP<0.05 vs health control; cP<0.05 vs disease control.表2  外周血T细胞亚群上CD152分子的表达（略）Tab 2  Expression of CD152 on T cell subsets in the peripheral bloodaP<0.05 vs health control;

23、cP<0.05 vs disease control; eP<0.05 vs 2 week treatment; gP<0.05 vs 1 month treatment.2.4  外周血T细胞亚群上PD1分子的表达分析  疾病对照组CD4+T细胞和CD8+T细胞上PD1分子的表达与健康对照组相比均无统计学意义, 但是CD4+T细胞上和CD8+T细胞上PD1分子的表达比例明显高于健康对照组(P<0.05), 且CD4+T细胞上PD1的表达也明显高于CD8+T细胞上的表达。肝移植术后T细胞亚群上PD1的表达均逐渐升高。CD4+T细胞上PD1的表达在2周

24、开始明显高于健康对照组(P<0.05); CD8+T细胞上PD1的表达从治疗1月后明显高于疾病对照组(P<0.05)。治疗2周时CD4+T细胞上PD1的表达明显高于CD8+T细胞上的表达(P<0.05)。CD4+和CD8+T细胞上PD1的表达比例在术后较疾病对照有所下降, 但较健康对照组仍较高(P>0.05, 表3)。表3  外周血T细胞亚群上PD1分子的表达（略）Tab 3  Expression of PD1 on T cell subsets in the peripheral bloodaP<0.05 vs health control

25、; cP<0.05 vs disease control; eP<0.05 vs PD1+/CD4+.3  讨论    T细胞活化需要MHC抗原肽提供的第1信号和协同刺激分子提供的第2信号。协同刺激分子又分为正性和负性协同刺激分子, 正性分子启动T细胞的活化, 负性分子限制T细胞的过度活化, 使免疫应答维持在一定的水平。经典的正性分子为CD28, 其与抗原提呈细胞上的B7分子结合后, 提供T细胞活化信号, 使T细胞激活。与其对应的负性分子为CD152, 它仅表达在活化的T细胞上, 并与CD28竞争B7分子, 抑制T细胞的过度激活。PD1是一种

26、新发现的负性协同刺激分子, 属于CD28/CTLA4超家族。它主要表达在活化的T细胞、  B细胞和单核细胞表面, 在巨噬细胞和NKT细胞表面也有表达2。PD1与其配体偶联后向胞内转导抑制信号, 抑制T、 B淋巴细胞等的增殖活化。CD152和PD1虽均为负性协同刺激分子, 但由于其表达与结构的差异, 在调节T细胞活化中的作用也存在着不同3。CD152主要在淋巴器官调节初始T细胞的活化, 而PD1则在淋巴器官内外调节T细胞的活化和效应阶段。研究表明CD152和PD1在移植免疫耐受中发挥了非常重要的作用, 阻断CD152或PD1信号将导致移植耐受诱导失败4-6。  &#

27、160; 本研究结果显示疾病对照组CD4+T细胞百分率明显高于健康对照组, 而CD8+T细胞明显低于健康对照组, 提示终末期肝脏疾病患者体内存在T细胞亚群平衡紊乱。肝移植术后CD4+T细胞百分率逐渐降低, 而CD8+T细胞百分率逐渐增加, 表明经过治疗T细胞亚群平衡紊乱得到纠正。术后经治疗CD4+和CD8+T细胞上CD152的表达均高于健康对照组, 且在治疗2周和1周时高于疾病对照组, 提示FK506能上调CD152的表达, 抑制T淋巴细胞的过度活化。有研究显示CD152主要抑制CD8+T细胞的增殖活化, 并对可诱导的调节性T细胞的产生具有重要作用7-9。本结果显示CD152信号对CD4+和C

28、D8+T细胞的作用并无明显差异, 而CD8+T细胞较健康对照并无明显降低, 我室已有结果显示肝移植后CD8+CD28-调节性T细胞较对照组明显增多, 提示CD152主要抑制了CD8+效应T细胞的活化, 从而有利于移植免疫耐受的诱导。肝移植术后CD4+和CD8+T细胞上PD1的表达呈上升趋势, 即FK506能上调PD1分子的表达, 抑制淋巴细胞的过度活化; 而CD4+PD1+T细胞较健康对照组明显升高, 而CD8+PD1+T细胞与健康对照组比较无统计学意义, 提示CD4+T细胞上PD1表达增加比CD8+T细胞更加明显, 而有人对心脏移植模型进行研究发现PD1主要起下调CD4+T细胞的作用10,

29、这可能是肝移植受者T细胞亚群中CD4+T细胞百分率逐渐下降的原因之一。近期研究显示, PD1对CD4+CD25+调节性T细胞的抑制活性具有非常重要的作用。阻断PD1信号可降低调节性T细胞的抑制能力, 并恢复CD4+CD25-T细胞在体外的增殖11。有人提出PD1在免疫耐受中的作用可能一方面是通过转导抑制性信号, 另一方面是通过调节性T细胞起作用12。因此, PD1信号在移植免疫耐受中发挥了重要作用, 可作为一个新的生物治疗靶点。    总之, FK506能上调T细胞表面负性协同刺激分子CD152和PD1的表达, 但是具体作用有所区别, CD152信号对CD4+和CD8+T细胞作用无明显差异, 而PD1信号主要发挥抑制CD4+T细胞的效应, 从而有利于抑制效应T细胞的过度增殖与活化, 维持移植受者的存活和免疫稳态。【】  1 Ke