B7修饰的肝癌细胞疫苗对细胞因子产生的研究

1、B7修饰的肝癌细胞疫苗对细胞因子产生的研究摘要：目的研究B7基因修饰的肝癌细胞疫苗刺激产生细胞因子(IL-2，TNF-和G-CSF)的能力。方法应用逆转录病毒载体，将B7-1、B7-2基因导入小鼠肝癌细胞Hepal-6细胞株中，获高表达B7分子的阳性细胞克隆，经丝裂霉素C(MMC)处理，制备肿瘤细胞疫苗(TCV)，观察TCVB7体内外对细胞因子IL-2，TNF-和C-CSF产生的影响。结果(1)TCVB7体外能刺激脾细胞分泌细胞因子IL-2，TNF-和G-CSF；(2)TCVB7免疫的小鼠，其血清IL-2和G-CSF水平升高。结论B7基因修饰的肝癌细胞疫苗能刺激产生细胞因子IL-2，TNF-和

2、G-CSF。关键词：CD80(B7-1)CD86(B7-2)肿瘤疫苗细胞因子小鼠肝细胞癌Studies on cytokines induced by tumor cell vaccines transfected with the genes encoding murine B7-1 or B7-2LIU Xiaoping, OU Qingjia, HUANG Honglian, et al.（Department of Surgery, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Gu

3、angzhou 510120）Abstract：ObjectiveTo study the cytokines induced by tumor cell vaccines (TCV) transfecting the genes encoding murine B7-1 or B7-2. MethodsThe retrovirus vector was used to transfer the B7-1 or B7-2 gene into syngeneic murine hepatocellular carcinoma cell line Hepal-6, termed as Hepal-

4、6-B7-1 or Hepal-6-B7-2, respectively, and the TCVB7 were obtained by treating them with mitomycin C(MMC). The IL-2, TNF- and G-CSF induced by TCVB7-1, TCVB7-2 or TCVHepal-6 were investigated in vitro or in vivo. Results(1)Higher levels of IL-2、TNF- and G-SCF were obtained by coincubating spleen cell

5、s with TCVB7 in vitro. (2) Higher serum levels of IL-2 and G-CSF were obtained by inoculating syngeneic mice with TCVB7. ConclusionsHigher levels of IL-2, TNF- and G-CSF can be induced in mice by TCVB7.Key words：CD80(B7-1)CD86(B7-2)Cancer vaccineCytokineMouseCarcinoma, hepatocellular在T细胞激活过程中，除了MHC-

6、TCR-抗原多肽三元体构成的第一信号外，协同刺激分子(costimulatory molecules, CMs)提供的第二信号也起极为重要的作用，它决定着T细胞是增殖、分化为效应细胞，还是进入克隆无能(clone anergy)或凋亡1。B7分子及其受体(counter receptor)在T细胞激活双信号系统中，提供主要的协同刺激信号。在缺乏CMs的肿瘤细胞中导入CMs制备瘤苗，成为近来肿瘤生物治疗的研究热点2。我们的研究也发现，在缺乏B7的小鼠肝癌细胞Hepal-6细胞株中导入B7-1、B7-2基因制备成的肿瘤细胞疫苗，体内、外抗肿瘤作用明显增强。作者应用上述基因工程肿瘤细胞疫苗(tumo

7、r cell vaccine, TCV)，分别观察了TCVHepal-6，TCVB7-1，TCVB7-2体内、外刺激产生细胞因子IL-2，TNF-和G-CSF的能力，籍以对其抗肿瘤作用机制作进一步的探讨。现将结果报道如下。材料与方法一、材料Con-A，G418，Polybrene，MTT，SDS，胰酶：均为美国Sigma公司产品。MMC：Kyowa Hakko Kogyo公司产品。放线菌素D(ACD)：Fluka公司产品。胎牛血清(FCS)：中国医学科学院血液学研究所产品。培养液：DMEM和RPMI 1640各一半加体积分数为10% FCS+双抗。苏木素染料、结晶紫染料、淋巴细胞分离液均为国产

8、试剂。羊抗人IgG-FITC：军事医学科学院微生物流行病研究所产品。IL-2标准品、TNF-标准品、G-CSF标准品、CTLA-4Ig：为第一军医大学分子免疫研究所提供。小鼠肝癌细胞株Hepal-6、NIH3T3细胞株、含B7-1和B7-2基因的抗性包装细胞、L929细胞株、NSF-60细胞株：第一军医大学分子免疫研究所提供。C57BL/6小鼠：5-6周龄，雌性，第一军医大学动物中心提供。二、方法1.B7基因转染小鼠肝癌细胞Hepal-6：参照文献3，收集病毒上清，NIH3T3细胞检测病毒上清滴度，G418筛选病毒上清感染的Hepal-6细胞，CTLA-4Ig的间接免疫荧光法，检测细胞表面B7

9、分子的表达情况。2.肝癌细胞疫苗的制备：收集培养的Hepal-6，Hepal-6-B7-1，Hepal-6-B7-2细胞，Hanks液洗涤2次 ，调细胞浓度为1107/ml，MMC浓度为80 g/ml，37、5%CO2 1h，Hanks液洗涤3次，洗去残余MMC，重悬细胞悬液，备用。(肝癌细胞疫苗分别称为TCVHepal-6，TCVB7-1，TCVB7-2)。3.IL-2的测定方法：参照文献4，采用小鼠脾T母细胞的MTT法。无菌取小鼠脾脏，研磨，过200目钢网，0.87%氯化铵(30-60) s溶解红细胞，Hanks液洗涤3次 ，用含(5-10) g/ml ConA、青、链霉素各100 U/m

10、l、10%小牛血清的1640培养液制成1107/ml细胞悬液， 37、5%CO2培养(48-72) h，细胞悬液用淋巴细胞分离液分离，离心，1?500 r/min，15 min，取中间层淋巴细胞。Hanks液洗涤2次，计数，调细胞浓度为1106/ml。取100 l的待测样品及稀释IL-2标准品(浓度为100 U/ml)，于96孔培养板内作倍比稀释，设3个复孔及阴性对照(培养液)，每孔另加入上述细胞悬液各100 l，37、5%CO2培养24 h，或观察至阴性对照组细胞全部死亡时，进行MTT检测。于96孔培养板中每孔加入MTT 10l，37、5%CO2培养(4-6) h，每孔吸取上清100 l后加

11、入10%甲月赞溶解缓冲液100 l，充分吹打混匀或过夜，于酶标分析仪上测定570 nm的吸光度(A)值。4.TNF-的测定方法：参考文献3，采用对小鼠L929细胞的细胞毒效应的结晶紫检测法。在酶标分析仪上测定570 nm的A值(空白对照调零)，以杀死50%的TNF-最大稀释倍数的倒数定为其活性单位。5.G-CSF的测定方法：参考文献5，采用G-CSF依赖的NSF-60细胞株作为靶细胞的MTT法。用含15%小牛血清、G-CSF 25 ng/ml、青、链霉素各100 U/ml的RPMI 1640培养液培养NSF-60细胞，检测时收集细胞悬液，Hanks液洗涤3次，调细胞浓度为1105/ml，备用。

12、取100 l的待测样品及稀释G-CSF标准品(浓度为10 ng/ml)，于96孔培养板内作倍比稀释，设3个复孔及阴性对照(培养液)组，每孔另加入上述细胞悬液各100 l，37、5%CO2培养44 h，或观察至阴性对照组细胞全部死亡时，MTT法检测。于96孔培养板中每孔加入MT 20 l，37、5%CO2培养(4-6) h，每孔吸取上清100 l后加入10%甲月赞溶解缓冲液100 l，充分吹打混匀或过夜，于酶标分析仪上测定570 nm的A值。B7体外对脾细胞产生细胞因子功能的影响：常规无菌取小鼠脾细胞，调细胞浓度为1107/ml，置12孔培养板，分别加入培养液，TCVHepal-6，TCVB7-

13、1，TCVB7-2，细胞浓度为5105/ml(脾细胞与TV比例201)，37、5%CO2B7体内对血清细胞因子浓度的影响：C57BL/6小鼠32只，随机分对照组、TCVHepal-6组、TCVB7-1组、TCVB7-2组，每组8只，分笼饲养。分别皮下接种NS，TCVHepal-6，TCVB7-1，TCVB7-2，细胞浓度为每鼠1107，7 d后再分别接种各种TCVs一次，一周后，小鼠眼球取血，收集血清，用于检测细胞因子。8.统计学处理：采用中国医学百科全书统计学分册统计处理软件处理。结果B7-1，TCVB7-2和TCVHepal-6对脾细胞产生CKs功能的影响：结果表1所示，TCVB7-1，T

14、CVB7-2与小鼠脾细胞共同培养，其上清中IL-2，TNF-和G-CSF水平上升，而TCVHepal-6组和对照组IL-2，TNF-和G-CSF未测出，说明TCVB7-1、TCVB7-2在体外能刺激脾细胞产生IL-2，TNF-和G-CSF(TCVB7-1和TCVB7-2组与TCVHepal-6组和对照组比较，P0.01)。表1TCVB7-1，TCVB7-2，TCVHepal-6对脾细胞产生CKs的影响(s)组别IL-2(U/ml)TNF-(U/ml)G-CSF(ng/ml)标准品浓度1002010对照组-Hepal-6-Hepal-6-B7-1*Hepal-6-B7-2*与对照组及亲本Hepa

15、l-6组比较，* P0.01 B7-1，TCVB7-2和TCVHepal-6对血清CKs的影响：结果如表2所示，用TCVB7-1，TCVB7-2免疫接种2周后，其血清中IL-2和G-CSF的水平明显升高，但TNF-未检出。表2TCVB7-1，TCVB7-2，TCVHepal-6对血清CKs浓度的影响(s)组别IL-2(U/ml)TNF-(U/ml)G-CSF(ng/ml)标准品浓度1002010对照组-Hepal-6-Hepal-6-B7-1*-*Hepal-6-B7-2*-*与对照组及亲本Hepal-6组比较，*P0.01 讨论肿瘤特异性主动免疫治疗(active specific immu

16、notherapy, ASI)一直是肿瘤免疫治疗的主要内容，但由于受困于对肿瘤抗原的认识，近一个世纪以来几经波折，直到最近，由于肿瘤抗原的分离以及基因工程疫苗的出现，ASI的前景又显曙光，对ASI的研究也日渐广泛而深入。目前，人们已经将各种细胞因子及其他分子的基因导入各种肿瘤细胞，从现有的研究成果来看，以GM-CSF基因转染的瘤苗效果最佳6。B7分子在T细胞激活过程中提供主要的协同刺激信号，其与受体对CD28和CTLA-4的结合，产生不同的生物学及免疫学的效应，体现了机体对免疫自稳的精细正负调节机制。即使肿瘤细胞具有肿瘤排斥抗原，如果缺乏协同刺激分子B7，也不能引起有效的免疫应答。有资料表明，

17、大多数小鼠肿瘤细胞株及人类肿瘤细胞均不表达B7分子7。而在缺乏B7分子的肿瘤细胞中转入B7基因，则可提高肿瘤细胞的免疫原性，促进T细胞的增殖和活性，增强机体对肿瘤的免疫抵抗能力。我们的研究也显示，小鼠Hepal-6细胞株也缺乏B7分子的表达，且转B7基因的肝癌瘤苗能对同系肝癌细胞产生完全的免疫保护作用及较好的治疗作用8，9。CD28与B7结合产生协同刺激信号，调节着机体CD4+和CD8+T细胞的抗肿瘤效应。CD4的TH1细胞主要产生IL-2，IFN-，TNF-，GM-CSF等细胞因子，TH2细胞主要产生IL-4，IL-5，IL-6，IL-13。本研究的结果显示，TCVB7体外与脾细胞共育，其培

18、养上清中IL-2，TNF-和G-CSF的水平上升，而用TCVB7免疫小鼠后，其血清中IL-2和G-CSF水平上升。CD4+T细胞通过诱导细胞因子的产生，调控着B细胞、单核巨噬细胞、CD8+T细胞的激活，在抗原特异性免疫应答过程中起重要作用。因此，我们认为，激活CD4+的TH1细胞分泌上述细胞因子并间接激活CD8+细胞是TCVB7抗肿瘤作用的机制之一。作者单位：刘晓平（510120广州市，中山医科大学孙逸仙纪念医院外科）区庆嘉（510120广州市，中山医科大学孙逸仙纪念医院外科）黄洪莲（第一军医大学分子免疫学研究所）王小宁（第一军医大学分子免疫学研究所）参考文献：1Harding FA, McA

19、rthur JG, Gross JA, et al. CD28-mediated signalling co-stimulates murine T cells and prevents induction of anergy in T-cell clones. Nature, 1992, 13： 173-179.2Fenton RT, Sznol M, Luster DG, et al. A phase trial of B7-transfected or parental lethally irradiated allogeneic melanoma cell lines to induce cell-mediated immunity against tumor-associated antigen presented by HLA-A2 or HLA-A1 in patients with stage melanoma. Human Gene Ther, 1995, 6：87-106.3楼国良，曹雪涛，闵碧荷，等.腹腔内注射TNF基因转染的LAK细胞对于腹水型肝癌小鼠的疗效.中国肿瘤生物治疗杂志，1995，2：32-33.4朱直芬，张悦，王晓林，等.MTT比色法检测IL-2和杀伤细胞活性的研究.免疫学杂志，1994，10：48-50.5Wang HB. Comp