hβ2亚基在BK通道孔中的作用位点探测及TRPV1通道的脱敏机制

1、h2亚基在BK通道孔中的作用位点探测及TRPV1通道的脱敏机制    现代生命科学的发展改变着人们对生命获得过程的认识,而离子通道的研究不仅与信号发生、传递和转导紧密关联,同时也涉及到诱发各种遗传或非遗传疾病的分子机制。了解离子通道的精细结构,探讨离子通道的门控机制和动力学特性,弄清楚离子通道结构和功能之间的关系意义重大。本研究工作由两部分组成:第一部分探讨了钙和电压激活的大电导钾离子通道(Maxik通道,又名BK通道)的2亚基N端失活域在由亚基组成的孔道中的作用位点;文章第二部分则是讲述痛觉敏感型通道TRPV1的适应性调节的分子机制的。BK通道广泛地存

2、在于可兴奋细胞,特别是神经系统中,具有调节胞内钙浓度和膜电位等重要生理功能。目前,电压依赖型钾离子通道(Kv通道)的研究已取得较大进展。BK通道与Kv通道在结构和功能上既存在某些相似之处又各具特点。如它们都结合有辅助亚基,并由亚基的N端疏水性氨基酸残基堵塞孔道引起N型失活。然而现有实验结果表明,K通道的孔道阻断剂(如TEA、QX-314等)能够减慢Kv通道的失活过程,然而却不能减慢BK通道的失活。为什么这两者如此不同?BK通道的B2亚基N端失活域是否进入由亚基组成的BK孔道?两者究竟发生了怎样的相互作用?阻断剂为什么不和失活域在孔道中竞争结合位点?本课题的研究目的之一即是要回答和解决这些目前仍

3、然困扰我们的问题。我们将h2 N端的前三个氨基酸FIW突变为FWI,发现h2的这一突变体h2-FWI对BK通道的失活没有影响,但通道的失活恢复曲线却由单指数转变为双指数。利用h2-FWI的双指数恢复特性变化作为两者间相互作用的判定依据。通过丙氨酸扫描(Alaninescanning),即将亚基形成孔道的S6区疏水性氨基酸依次突变为疏水性较弱的丙氨酸,然后通过膜片钳实验记录分析失活后通道的恢复特性变化,进而了解两者间的相互作用。借助作为通道孔道阻滞剂的麻醉剂QX-314和TEA等药物进一步解释了BK通道失活的非竞争机制。我们得到了如下几个结论:(1)位于mSlo1孔道中的氨基酸Ile-323是在

4、失活过程中与2亚基N端失活域有相互作用的主要位点。孔道内的另外两个氨基酸M314和V319也参与了这一过程。根据h2-FWI亚基N末端的线性结构特点,我们推测mSlo1孔道与h2-FWI在BK通道失活过程中存在如下的相互作用关系:1323-I,V319-W,M314-F,其中1323起着主导性的作用。同时进一步明确了2亚基的失活域的确进入了BK通道的孔道从而引起通道的失活。(2)通道阻滞剂QX-314和TEA在BK孔道内无特异性的结合位点。因此胞内阻断剂不会像在Kv通道中那样减慢通道的失活过程,这是因为2 N端失活域的作用位置比较靠近孔道口,即孔道内的最后一个疏水性氨基酸Ile-323,而QX

5、-314的作用位置位于孔道内,因此QX-314不会与失活域竞争相同的作用位点,从而不会影响2引起的通道失活过程。根据实验结果,我们提出了一个全新的非竞争模型,该模型不仅可以很好的解释我们的数据,而且为进一步阐释BK通道的结构和门控机制提供了重要的实验和理论支持。(3)我们的实验结果还显示:与野生型mslo1通道电流相比,突变型1323A不管是单通道还是宏观电流均有明显差异,表现为出现了野生型通道所不具有的外向整流特性。形式上突变型1323A的单通道出现了非常像噪声的电流,同一电压下可以同时记录得到几个不同大小的单通道电流,即是说Ile-323A还引起了BK通道电导的改变。据此我们推测Ile-3

6、23对BK通道具有双重作用,既是2失活域在孔道中的作用位点,同时还能调节BK通道的门控特性。另外还发现一个非常有趣的现象,312位点的Leu亮氨酸残基的突变能够极大地改变BK通道的电压依赖性。我们研究小组在后续的两篇文章中分别证明了这两点推测:Ile-323确实为BK通道的关节所在,323点的氨基酸残基疏水性降低,会使得“关节”变得松弛,进而导致通道开放时四个亚基间协同性的不一致和开放几率的改变(Guo et al,Biophys J.2008 May 1;94(9):3714-25)。而Leu312位点则可以极大地增强BK通道的电压敏感性(Wu et al.,In review)。适应性调节

7、是大部分感觉器官共有的一种性质,但是痛觉适应性产生的根源和机理仍然不为人们所知。文章的第二部分在受体水平探讨了伤害感受器TRPV1通道的适应性调节的分子机制。我们发现通道在脱敏反应发生后,仅改变了通道对激动剂的敏感性,而不影响最大电流的响应,据此,我们在脱敏感念的基础上提出了痛觉适应性调节概念。该部分我们主要得到以下几个主要结论:(1)Ca(2+)经由开放的TRPV1通道内流引起脱敏反应的发生,脱敏反应发生后仅改变了通道对辣椒素的敏感性,浓度敏感性降低了14倍,但这一改变并不影响通道的功能。(2)通过联合应用全内反射荧光显微技术和膜片钳记录技术,我们证实了PIP2参与了TRPV1通道脱敏反应的

8、发生,PIP2分解的速率和量的变化都足以改变通道对激动剂的响应。借助药物Rapamycin专一性降低细胞内PIP2含量作为研究工具,通过测量通道对辣椒素浓度依赖性曲线,我们进一步量化了PIP2对脱敏反应的贡献,约占60%。(3)我们还发现TRPV1通道对激动剂敏感性的改变依赖于刺激强度,不同的刺激强度得到不同程度的脱敏响应。我们推测有两种可能性:一是通道蛋白有记忆功能,这种可能性比较小;二是不同刺激强度作用下的TRPV1通道离子通透性不同,因此,内流Ca(2+)的量和分布特性不同,导致PIP2分解量不同,从而引起不同程度的脱敏反应。同主题文章1.    

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