RNA干扰分化抑制因子-1基因表达对食管鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响

1、RNA干扰分化抑制因子-1基因表达对食管鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响         10-11-15 13:47:00     编辑：studa20                        作者：曾达武， 方明霞， 刘豫瑞【摘要】 

2、目的 研究针对分化抑制因子-1的siRNA(si-Id-1)对人食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞增殖和凋亡影响的可能机制。 方法 阳离子脂质体法介导si-Id-1转染ESCC TE-1细胞株，倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化并计算转染率，RT-PCR检测Id-1的mRNA表达水平;免疫印迹法检测Id-1的蛋白表达水平;细胞增殖实验检测转染前后TE-1细胞增殖能力变化;流式细胞术检测各组细胞的周期变化和凋亡指数。 结果 si-Id-1转染前后的TE-1细胞株Id-1的mRNA和蛋白表达水平有明显差异(P<0.05);转染后的TE-1细胞较其亲代细胞增殖能力降低，凋亡程度增强(P<0.

3、05);转染后的TE-1细胞周期停滞在G0/G1期，G1期细胞数增多，S期细胞数减少(P<0.05)。 结论 利用脂质体将si-Id-1转染至ESCC的TE-1细胞是切实可行的;si-Id-1可以有效沉默TE-1细胞Id-1的表达，从而抑制ESCC细胞增殖。 【关键词】  抑制因子，免疫; 癌，鳞状细胞; 食管肿瘤; RNA，小分子干扰; 细胞凋亡; 细胞增殖在我国，食管癌具有高发病率及高病死率，以手术为主辅以放射治疗或化学治疗的综合治疗可提高患者生存率，但仍有90%的患者死于转移和局部复发1，因此寻求新的切实有效的食管癌治疗方法或策略迫在眉睫。分化抑制因子(inhibitor

4、 of DNA binding or differentiation, Id-1)可在食管癌、肝癌等肿瘤中表达，参与肿瘤血管发生、促进肿瘤生长及转移2-4;而小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)可有效沉默目标基因，而不影响正常基因5。该研究针对si-Id-1对人食管鳞状细胞癌(ESCC)TE-1细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响，探讨其对ESCC增殖和凋亡影响的可能机制。1 材料与方法1.1 主要试剂 Id-1-siRNA、Lipofectamine2000(广州锐博生物公司)，人食管鳞状细胞癌ESCC TE-1细胞(上海拜力生物公司，ATCC来源)，Tri

5、zol Reagent(美国Invitrogen公司)，RT-PCR试剂盒(美国Fermentas公司)，兔抗人Id-1多克隆抗体、Western印迹荧光试剂(美国Santa Cruz公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁株氏会社产品)，Taq酶(北京天庚生化公司)，Annexin V/PI凋亡试剂盒(美国Beckman公司)。1.2 分组 空白对照组：正常培养TE-1细胞组;转染试剂组：仅加入Lipofectamine 2000组;转染对照组：转染非特异性序列NContml-05815的细胞组;转染实验组：转染si-Id-1组。1.3 方法1.3.1 TE-1细胞培养和脂质体介导的siRNA转染

6、效率 ESCC TE-1细胞培养于含10%FBS的RPMI 1640培养液，于37 、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代。以105 mL-1的细胞密度接种培养，细胞80%融合后，用Lipofectamine 2000转染试剂进行转染。3组siRNA均由广州锐博生物公司设计与合成。Si-Id-1-001(19 bp)：5'-UGA GCA AGG UGG AGA UUCU dTdT-3'3'-dTdT ACU CGU UCC ACCU CUA AGA-5'Si-Id-1-002(19 bp)：5'-CAU GAA CGG CUG

7、 UUA CUC A dTdT-3'3'-dTdT GUA CUU GCC GAC AAU GAGU-5'Si-Id-1-003(19 bp)：5'-GUU GGA GCUGAA CUC GGAA dTdT-3'3'-dTdT CAA CCU CGA CUU GAG CCUU-5'另外，本实验还将标记FAM的siRNA同时转染至TE-1细胞，分别于转染6，24，48和60 h后通过荧光倒置显微镜观察含有荧光的细胞所占比例以及转染前后的细胞形态变化，据此估计siRNA的转染效率。1.3.2 RT-PCR检测Id-1的mRNA表达 用Triz

8、ol一步法提取TE-1细胞总RNA，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测纯度并定量。然后以mRNA为模板，Oligo(dT)18为引物，逆转录成cDNA，反应总体积为20 L，RT-PCR反应条件为42 孵育60 min，70 中止10 min。Id-1的PCR反应引物由上海生物工程公司设计和合成，扩增片段大小为416 bp。上游引物(Id1-P1)：5'-CAG CAC GTC ATC GAC TAC ATC A-3'下游引物(Id1-P2)：5'-GAA TCC CAC CCC CTA AAG TCT C-3'以-肌动蛋白(-actin)的一段扩增序列为

9、内对照，扩增片段大小为556 bp。上游引物(-actin-P1)：5'-AAA GAC CTG TAC GCC AAC ACAG-3'下游引物(-actin-P2)：5'-TTT TAG GAT GGC AAG GGA CTT C-3'反应体系：1×PCR Buffer，dNTP 0.2 mmol/L，cDNA模板200 ng，引物浓度0.4 mol/L，Taq酶1.25 U，反应总体积25 L。反应条件：94 预变性5 min;94 30 s57 30 s72 45 s，共30个循环;72 最后延伸7 min。最后的PCR扩增产物用凝胶图像分析系统进行灰度扫描。目的基因的表达指数=目的基因条带的积分密度值/内对照条带的积分密度值1.3.3 Western blot法检测Id-1的蛋白表达 siRNA转染TE-1细胞60 h后以RIPA缓冲液4 裂解30 min，离心，取上清并采用BCA进行蛋白定量。各组采用同样的蛋白量上样，在SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后转膜，封闭液封闭1 h，加Id-1抗体(11 000)4 过夜，洗去未结合的一抗，以Western blot