组蛋白乙酰化在吗啡戒断及其相关环境线索记忆中的作用研究

1、组蛋白乙酰化在吗啡戒断及其相关环境线索记忆中的作用研究上海医学院04基础医学 王雪复旦大学药理研究中心 马兰 教授摘 要：目的：研究组蛋白乙酰化是否影响药物戒断和环境线索记忆。方法：采用吗啡慢性给药、纳洛酮急性促戒断和去乙酰化酶抑制剂丁酸钠的干预形成的大鼠CPA模型，分为吗啡生理盐水生理盐水组、吗啡纳洛酮生理盐水组、吗啡纳洛酮丁酸钠组，观察记录戒断症状，并用免疫组化方法观测大鼠大脑海马下托区乙酰化（H3K14Ac）水平以及c-fos蛋白的激活情况。结果：与对照组吗啡生理盐水生理盐水组相比，吗啡纳洛酮生理盐水组表现出明显的戒断症状，吗啡纳洛酮丁酸钠组的戒断症状依然存在，但比吗啡纳洛酮生理盐水组相

2、对较弱。免疫组化染色中，乙酰化水平(H3k14Ac)对照组与吗啡纳洛酮生理盐水组相近，而吗啡纳洛酮丁酸钠组明显上调；c-fos水平吗啡纳洛酮丁酸钠组最高，吗啡纳洛酮生理盐水组居中，吗啡生理盐水生理盐水组最低。结论：丁酸钠可以减弱纳洛酮形成的戒断症状；已完成的部分CPA测试结果也提示纳洛酮可以减弱CPA和戒断记忆的形成（结果未给出）。组蛋白乙酰化的改变可能引起了海马下托区基因表达的改变，进而影响药物戒断和环境线索记忆的动物行为学。关键字：药物成瘾，戒断，条件性位置厌恶（CPA），表观遗传学，组蛋白乙酰化Abstract: Conditioned reinforcement is hypothes

3、ized to be critically involved in drug addiction as a factor contributing to compulsive drug use and relapse. The present study focused on the neurobiology involved in the acquisition and expression of conditioned reinforcing effects of morphine withdrawal employing a conditioned place aversion (CPA

4、) paradigm in chronic-dependent rats. On the other hand, a group of sodium butyrate pretreated mice was aimed at accessing the effect of histone acetylation. The result showed the sodium butyrate group express lighter withdrawal symptoms than the control group, which indicated sodium butyrate could,

5、 weaken the effect of naloxone. The level of c-Fos in the hippocampus following naloxone-precipitated withdrawal (including a sodium butyrate pretreated group) showed that the sodium butyrate group revealed most c-fos positive expression, the saline group revealed the least while the naloxone-only g

6、roup revealed the middle, which indicated there are indeed relationships between histone acetylation and related aversion memory, and the possible mechanism of gene expression effected by histone acetylation. Key words: drug addiction, withdrawl, Conditioned Place Aversion, epigenetic, histone acety

7、lation药物成瘾是一种慢性复发性脑疾病1 ，滥用者为了追求药物带来的愉悦感和欣快感，会不顾后果的寻求和使用药物2，这种异常行为表现的产生随着反复用药而渐进性发展的。研究发现，滥用者在停止用药以后，即使远离药物数月甚至更长的时间，仍会因为某些因素而诱发其重新滥用药物。这种行为在临床上称为复吸。滥用者长期、反复滥用药物，会造成一种机体的适应状态，只有继续使用药物才能维持正常的生理状态，而一旦中断用药（或突然减少用量），便会出现一系列生理功能的紊乱，称之为戒断。 戒断是引起复吸的一个重要原因。在药物促戒断过程中，给予实验动物一个特定的环境，它会将生理不适与当前的环境线索联系在一起，当再次放入相同

8、环境后，会唤起动物对此环境厌恶的记忆，称为戒断记忆。以上都说明成瘾的异常行为涉及到大脑神经系统长期稳定的变化，出现了由药物诱导的行为和神经元突触可塑性的稳定变化。形成神经元可塑性变化的重要原因可能在于精神活性物质可以诱导相关脑区基因表达的改变。在动物模型上，研究者发现，在伏隔核，纹状体，杏仁核等多个成瘾相关脑区都有基因（如：c-fos, BDNF等）的表达发生了改变。到目前为止的研究发现，基因表达有两个重要的调控机制：一是转录因子如cAMP 反应元件结合蛋白(CREB)和FosB38，二是表观遗传学修饰。表观遗传是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变3。表观遗传学的研究内容包

9、括DNA的甲基化和染色质重塑等。DNA的甲基化是基因组DNA 的一种主要表观遗传修饰形式,是调节基因组功能的重要手段。染色质重塑是指组成核小体的组蛋白可以被多种化学加合物所修饰，如磷酸化、乙酰化和甲基化等，组蛋白的这类结构修饰可使染色质的构型发生改变，从而影响转录因子和转录起始复合物和基因转录启动区的结合，调节基因转录。组蛋白乙酰化是表观遗传学修饰的一种重要形式，已知组蛋白的乙酰化可以促进基因转录，而反之去乙酰化则抑制基因的转录。Nestler4等研究结果显示急性可卡因处理可以诱导大鼠纹状体c-fos基因启动子区组蛋白H4乙酰化增加， 持续的可卡因刺激可以诱导FosB基因启动子区的组蛋白H3乙

10、酰化。组蛋白脱乙酰化酶抑制剂丁酸钠增强大鼠脑内的乙酰化水平后，能增强可卡因的奖赏效应5。这些结果提示成瘾性药物可诱导组蛋白乙酰化，继而导致某些基因表达的改变。已有研究表明环境线索记忆能诱导基因表达的改变。在吗啡的戒断记忆中，将大鼠放回之前发生戒断的环境中，可诱发c-fos基因的表达改变。在背景相关的记忆中也发现，回到以前的环境后，海马结构中zif268的表达上调。同时也有研究表明，背景相关的恐惧记忆模型中，抑制海马组蛋白3的乙酰化能增强大鼠的恐惧记忆。因此，本课题基于盐酸吗啡慢性给药和纳洛酮急性促戒断建成的CPA模型，以c-fos蛋白作为基因表达激活标记物，观测大鼠海马下托区神经元的活动情况，

11、以借此说明组蛋白乙酰化在吗啡戒断及相关环境线索记忆中的作用机制.1 材料和方法11 药品与器材盐酸吗啡注射液（Morphine Hydrochloride Injection）为沈阳第一制药厂 生产。 盐酸纳洛酮（Naloxone）为上海中科院提供。 丁酸钠（Sodium butyrate）为上海国药集团公司产品。 C-fos rabbit抗体为Santa Cruz公司产品。 Anti-rabbit E为Vector公司产品。羊血清为Sigma公司产品。DAB(C12H14N4·4HCl·2H2O)为生工生物工程（上海）有限公司产品。 PBS、TBS为本实验室自配。 中性树

12、胶（Neutral balsam）为国药集团化学试剂有限公司生产。 电热恒温水槽（DK-600型）为上海精宏实验设备有限公司制造。 CPA模型箱（30×60×30cm）为本实验室自备。 切片机（Leica Microsystems Nussloch GmbH Olympus）为D-69229 Nussloch。 摄片机规格为18.2 Color Mosaic。 CPA模型箱（30×60×30cm）1.2 动物分组和慢性吗啡处理 雄性SD大鼠20只（中国科学院上海动物中心），体重200g左右，随机分为5组，每组4只。其中包括吗啡生理盐水组(Mor + Sa

13、l + Sal)，吗啡纳洛酮组(Mor + Nal + Sal)，吗啡纳洛酮丁酸钠组(Mor + Nal + NaB)（按丁酸钠不同剂量100mg/kg,200mg/kg,400mg/kg分为三组）。实验前先将大鼠放入箱内适应，每次一只，一次50min，并且在适应后的下一天测基础值：将大鼠放入测试箱15min并能在两侧自由移动，记录它在两侧分别停留的时间，看有无基础偏好。吗啡为连续7天递增腹腔给药，从10mg/kg到70mg/kg。每天给药时间为8：00和20：00，递增量为5mg，即第一天早晨给药10mg/kg，晚上给药15mg/kg；第二天早晨给药20mg/kg，晚上给药25mg/kg，依

14、此类推。至第七天早晨给药70mg/kg后分别做如下处理。1.3 纳洛酮促戒断，CPA模型的建立和丁酸钠对CPA形成的影响 第七天早晨给药70mg/kg一小时之后，吗啡纳洛酮组腹腔注射1mg/kg纳洛酮，吗啡生理盐水组注射与上等体积的生理盐水，吗啡纳洛酮丁酸钠组分别注射100、200或400mg/kg丁酸纳，再分别注射纳洛酮1mg/kg，以上各组分别放入箱的大鼠初始偏爱侧50min（插好隔板使之不能在两侧自由移动而只能停留在一侧）。观察大鼠的戒断症状，记录下列行为的次数：湿狗样抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、跳跃、上睑下垂，并在放入前和放入后分别称其体重和50min的粪便重，记录体重丢失量。1.

15、4 大鼠灌流处死及取脑 先后用250ml生理盐水和250ml4多聚甲醛灌流以处死大鼠，取脑，先用4多聚甲醛后固定6h，再分别用20和30的蔗糖溶液脱水（20蔗糖溶液脱水约需24h，30蔗糖溶液脱水约需48h72h），速冻于-70备用。1.5 切脑片及脑片处理 将脑片从-70冰箱取出，放入切片机左边的槽中。一般将刀片（切头）温度调为-20，切片机箱体温度调为25。脑片厚度定为30m。切至侧脑室等较易观察的地方时调节底座方向使两侧对称。当发现明显突起的上丘时可开始保留所切脑片，将玻璃盖板放下，匀速连续切脑片710片，用毛笔轻轻挑起放入盛有保护液的小烧杯中，再移至盛有保护液的12孔板中，标记，置于2

16、0冰箱备用。1.6 免疫组化 用ABC染色法观察c-fos在海马下托区被激活的情况从冰箱中取出样品（每组3张脑片），用PBS洗三次，每次十分钟（置于摇床上），洗后用滤纸吸水。取anti c-fos Rabbit 0.3l，按1:2000滴度稀释，放入一抗稀释液600l（其中含92PBS，5山羊血清，2TritonX-100(浓度10)）中。 将一抗稀释液分装在EP管中，每管120l，分别做标记，放入相应脑片，在摇床上shake一小时，放入4冰箱过夜。次日，取出脑片，用PBS洗三次，每次十分钟（置于摇床上），洗后用滤纸吸水。取l，按1:500滴度稀释，放入600l稀释液中，将此稀释液分装在EP管

17、中，每管120l，分别做标记，放入相应脑片，在摇床上shake一小时。取出脑片，用PBS洗三次，每次十分钟（置于摇床上），洗后用滤纸吸水。配置AB液，内含1.2lA、1.2lB和600l稀释液，EP管分装，室温下孵育40min。取出脑片，用PBS洗三次，再用TBS洗一次，每次十分钟（置于摇床上）。配DAB液，内含12mlTBS、6mgDAB、6l30H2O2，分装在12孔板中，每孔2ml，将脑片放入。染色约5min用自来水中止显色，裱片，过夜晾干。第三日，依次将裱好脑片的载玻片浸入75、85、95、100的酒精中脱水，每次10min。再浸入二甲苯中10min，使之透明。待干燥，用中性树脂加盖玻

18、片封片。 用ABC染色法观察海马下托区乙酰化（H3Ac(14K)）的情况从冰箱中取出样品（每组3张脑片），用PBS洗三次，每次十分钟（置于摇床上），洗后用滤纸吸水。取H3Ac(K14) rabbit 1.2l，按1:500滴度稀释，放入一抗稀释液600l（其中含92PBS，5山羊血清，2TritonX-100(浓度10)）中。 将一抗稀释液分装在EP管中，每管120l，分别做标记，放入相应脑片，在摇床上shake一小时，放入4冰箱过夜。次日，取出脑片，用PBS洗三次，每次十分钟（置于摇床上），洗后用滤纸吸水。取l，按1:500滴度稀释，放入600l稀释液中，将此稀释液分装在EP管中，每管120

19、l，分别做标记，放入相应脑片，在摇床上shake一小时。取出脑片，用PBS洗三次，每次十分钟（置于摇床上），洗后用滤纸吸水。配置AB液，内含1.2lA、1.2lB和600l稀释液，EP管分装，室温下孵育40min。取出脑片，用PBS洗三次，再用TBS洗一次，每次十分钟（置于摇床上）。配DAB液，内含12mlTBS、6mgDAB、6l30H2O2，分装在12孔板中，每孔2ml，将脑片放入。染色约5min用自来水中止显色，裱片，过夜晾干。第三日，依次将裱好脑片的载玻片浸入75、85、95、100的酒精中脱水，每次10min。再浸入二甲苯中10min，使之透明。待干燥，用中性树脂加盖玻片封片。1.7

20、 显微镜摄片，统计 用Olympus显微镜摄片，用Image-Pro Plus 5.1软件分析，并用Simga Plot v9.0软件统计数目。2 结果2.1 戒断症状纳洛酮促戒断症状明显，大鼠表现出激惹、腹泻、跳跃、体重减轻等症状。与对照组相比，吗啡纳洛酮生理盐水组和吗啡纳洛酮丁酸纳组均比吗啡生理盐水生理盐水组具有更明显的戒断症状。如表1所示。戒断症状大鼠编号戒断前体重（g）戒断后体重（g）体重减轻（g）湿狗样抖清理皮毛伸展跳跃上睑下垂MorNS1015000201000330200004023000Mor+NAL511015613431705436813225905221Mor+Nal+1

21、00mg/kg丁酸钠1009200113570312040041315201Mor+Nal+200mg/kg丁酸钠140131101523917161751111708104Mor+Nal+400mg/kg丁酸钠18212171319012515720137682102513表1由图1所示，其中体重减轻作为最明显和易于评估的一项指标，经卡方检验可发现，纳洛酮处理的大鼠与对照组对比的p<0.05，具有统计学意义，表明纳洛酮可以使大鼠产生戒断症状。经丁酸钠预处理的三组从图中发现，丁酸钠可以减弱纳洛酮产生的戒断症状，其中丁酸钠200mg/kg的剂量可使戒断症状减弱程度最小（本次实验p>0

22、.05，可以增大样本空间进行下一步实验继续测量）。 Mor+NS NSMor+NALMor+NAL+naBu100Mor+NAL+naBu200Mor+NAL+naBu400图12.2 免疫组化2.2.1 乙酰化染色（H3K14Ac）由图2所示，吗啡生理盐水生理盐水组和吗啡纳洛酮生理盐水组的H3K14Ac水平接近，吗啡纳洛酮丁酸钠组的H3K14Ac水平最高。（其中吗啡纳洛酮丁酸钠组的丁酸钠剂量为200mg/kg。）由图3所示，将上述三组的大鼠脑片经统计学方法检验，可从图中看出，吗啡生理盐水生理盐水组和吗啡纳洛酮生理盐水组的H3K14Ac水平接近(p>0.05)，不具有统计学差异。而吗啡纳

23、洛酮丁酸钠比吗啡生理盐水组生理盐水组表达更高(p<0.05)；也比吗啡纳洛酮生理盐水组表达明显更高（p<0.05），具有统计学差异。表明去乙酰化酶抑制剂丁酸钠明显增强了大鼠大脑海马下托区的乙酰化（H3K14Ac）水平，即表观遗传学修饰发生了改变。2.2.2 c-fos蛋白染色由图4所示，吗啡生理盐水生理盐水组的c-fos水平最低，吗啡纳洛酮生理盐水组的c-fos水平居中，吗啡纳洛酮丁酸钠组的c-fos水平最高。若要确定丁酸钠本身对CPA的影响，需在以后的研究中证实。（其中吗啡纳洛酮丁酸钠组的丁酸钠剂量为200mg/kg。）由图5所示，将上述三组的大鼠脑片经统计学方法检验，可从图中看

24、出，吗啡生理盐水生理盐水组的c-fos蛋白表达水平最低，吗啡纳洛酮生理盐水组的c-fos水平居中，吗啡纳洛酮丁酸钠组的c-fos水平最高。提示经纳洛酮处理的大鼠脑内海马下托区的基因表达可能发生了改变，而经过丁酸钠预处理的大鼠基因表达可能发生了更明显的改变。 图2 图3图4 图53 讨论药物诱发的条件性位置厌恶是与测量药物奖赏和厌恶性质的相关实验设计。在经慢性吗啡处理的大鼠形成吗啡依赖后，用纳洛酮急性促戒断时放入CPA测试箱的一侧，可引起大鼠的戒断症状和对该侧环境的厌恶，当厌恶记忆形成后，把它再放入相同的环境可再次诱发它的厌恶记忆，使之在该侧停留的时间减少，称之为条件性位置厌恶。本研究中所考察的

25、戒断反应包括利用条件性位置模型考察戒断诱发的CPA 和躯体戒断症状。躯体戒断症状主要记录了体重减轻、伸展、跳跃、站立、湿狗样抖等客观性强、易于观察的指标。可从结果表格中观察出对照组和纳洛酮组具有不同的戒断症状，其中p值均小于0.05，具有统计学意义，可证明大鼠形成了戒断症状。对于吗啡+纳洛酮+丁酸钠组，从体重减轻一项结果中可以发现，去乙酰化酶抑制剂丁酸钠可以减弱大鼠的条件性位置厌恶， 200mg/kg的剂量可以使戒断症状减弱程度最小。已经完成的CPA（结果未给出）提示与戒断症状相一致，在此基础上进一步推测其表观遗传学的改变是否有变化。组蛋白乙酰化属于表观遗传学的一种，组蛋白可通过磷酸化、乙酰化

26、和甲基化等结构修饰使染色质的构型发生改变，从而影响转录因子和转录起始复合物和基因转录启动区的结合，调节基因转录。已经知道，组蛋白的乙酰化可以促进基因转录，而反之，去乙酰化则抑制基因的转录7。已有研究表明，可卡因可诱导纹状体c-fos mRNA表达和组蛋白H3磷酸化乙酰化水平， 该效应可被HDAC抑制剂所协同， 说明在纹状体组蛋白乙酰化与基因表达之间具有明显的正相关。 相似的协同作用同样体现在可卡因行为学结果：组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠本身对运动能力没有影响，但可以显著增强可卡因对动物运动行为的影响。 以上结果提示，组蛋白乙酰化的水平和成瘾过程中诱导的某些基因的表达具有相关性，上调基因的启动子

27、区的乙酰化水平确实发生了改变。用药物干预组蛋白乙酰化的水平就可以避免药物诱发的行为学变化，说明了乙酰化水平与基因表达之间确实有内在的联系。海马是大脑重要结构，研究表明海马下托区作为海马的主要输出通路，在药物相关的环境线索诱发的药物寻求行为中起着关键作用。早期研究表明，在背景相关记忆中，回到以前的环境后，海马结构中zif268的表达上调；同时也有研究表明，背景相关的恐惧记忆模型中，抑制海马组蛋白3的乙酰化能增强大鼠的恐惧记忆。这表明药物诱发的环境记忆线索与海马区基因改变和组蛋白修饰有关。脑内的c-fos基因的表达与学习记忆过程与密切相关。由学习记忆所诱导的c-fos基因表达在脑内广泛分布，以皮层

28、、海马和边缘系统为多，已经知道，依学习记忆训练模型的不同，其表达时程有所差异；但一般于训练后立即或30分钟左右出现，12小时左右达峰值。被动和主动回避训练、光辨别训练及味觉厌恶性条件反射训练等多种学习记忆模型均可诱导脑内c-fos基因的表达。本实验即是旨在通过监测c-fos的表达，来反映干预组蛋白乙酰化对条件性位置厌恶训练的影响。从免疫组化染色的结果来看，大鼠海马下托区c-fos水平：经纳洛酮处理的比未经处理的更高，而经丁酸钠预处理的比另两者都高，海马下托区的c-fos蛋白的表达逐次上升，提示了该区的基因可能被激活。在乙酰化染色中可见，经过去乙酰化酶抑制剂丁酸钠预处理的大鼠海马下托区的乙酰化水

29、平最高（与另两组相比p值均小于0.05），而吗啡+纳洛酮与吗啡+生理盐水组的差异并不十分明显。与c-fos染色相对照，丁酸钠组的阳性率都为最高，提示海马下托组蛋白乙酰化与该区基因表达紧密相关，从而影响大鼠对环境线索的厌恶记忆，这些即提示了组蛋白乙酰化在阿片类药物戒断和相关环境线索记忆中的可能作用机制。至于丁酸钠本身对CPA的形成有无作用本实验并未涉及，将在以后的实验中进一步研究。另外，已知丁酸钠可以减弱纳洛酮的戒断症状并引起相关脑区的激活和乙酰化改变，反过来它是否影响CPA测试结果也将在以后的研究中进行。参考文献1 Koob GF ,Sanna PP ,Bloom FE. Neuroscience of addictionJ . Neuron ,1998 ,21 :4672476.2 Cami J ,Fare M. N Engl J Med ,2003 ,349 :975-86.3 Wolffe AP, et al. Science, 1999, 286 (5439) : 481486.4 Kumar A, et al. Neuron, 2005, 48: 303-314.5 Kmar A, Choi KH, Rent