缺血对大鼠大脑皮层神经元NMDA受体通道的影响

1、    缺血对大鼠大脑皮层神经元NMDA受体通道的影响*        摘要目的：研究“缺血”大鼠大脑大皮层神经元N-甲 基-D-天冬氨酸(NMDA)受体通道的单通道变化特征。方法：细胞贴附式膜片 钳技术。结果：在“缺血”状态下，NMDA受体通道35 pS和100 pS电导水平 的开放概率分别由对照组的0.079±0.006和0.067±0.004增加到0.308±0.155和0.488±0.1 26 (P0.01)，35 pS通道开放

2、时间常数2由对照值(4.17±0.38) ms增加到(8.54 ±2.05) ms(P0.01)，关闭时间由(75.50±14.10) ms缩短到(11.80±4.30) ms(P 0. 01)。结论：“缺血”可显著开放大鼠大脑皮层神经元NMDA受体通道，使钙 内流增加，对胞内钙超载起重要作用，此可能是脑缺血细胞损伤的机制之一。主题词局部缺血；神经元； 受体， N-甲基-D-天冬氨酸；离子通道 Effects of “ischemia” on NMDA-receptor-channelsin rat cerebra l cortical neuronsW

3、ANG Zhong-Feng, XUE Chun-Sheng, WAN Zi-Bing, LUO Quan-Sheng Department of Physiology, Third Military Medical University, ChongqingDepartment of Pharmacology, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing( 400046)Abstract AIM： To study the effects of “ischemia” on N-methyl- D-aspartate (NMDA) r

4、eceptor-channels in isolated rat cerebral cortical neurons. METHODS：Cell-attached configuration of patch clamp technique.RESULTS：During “ischemia”, the open probability of 35 pS and 100 pS NM DA-rec eptor channels increased from control values 0.079±0.006 and 0.067±0.004 to 0. 308±0.1

5、55 and 0.488±0.126, respectively(P0.01). The open time constant 2 of 35 pS channels increased from (4.17±0.38) ms to (8.54±2.05) ms(P 0.01) The close time constant decreased from (75.50±14.10) ms to (11.80 ±4.30) ms (P0.01).CONCLUSION：NMDA-receptor-chann els in rat cerebral

6、cortica l neurons were activated significantly during “ischemia”, which increases Ca 2 inflow and plays and important role in intracellular Ca2 overl oad. It was one of the cell injury mechanisms during cerebral ischemia.MeSHIschemia; Neurons; Receptors, N-methyl-D-aspartate; Ion channels兴奋性氨基酸是所有脊椎

7、动物中枢神经系统内的主要兴奋性递质，N- 甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体为其最重要的受体。NMDA受体介导了 广泛的生理和病理过程，包括神经的发育，可塑性，LTP的产生和兴奋毒等。NMDA受体耦联 的通道即NMDA受体通道。众多的学者认为脑缺血时，由于兴奋性氨基酸释放增多，从而激活 该通道，使其过度兴奋，产生离子的跨膜流动，其中以Ca2+为主，使细胞内钙浓度增 高1，2。本实验用细胞贴附膜片钳单通道记录技术研究大鼠大脑皮层神经元NMDA 受体通道在体外模拟缺血状态下的变化特征。材料与方法实验选用生后24周的Wistar大鼠，雌雄不拘，断头取脑，分

8、离顶叶及其周围皮层，用手 工切成厚约400500 m的冠状脑片，在通混合气(95% O2+5% CO2)的人工脑脊液内孵 育，人工脑脊液成分为(mmolL-1):NaCl 126; KCl 5;NaH2PO4 1.25；NaHCO3 26；CaCl2 2；MgSO4 2; HEPES 10；葡萄糖10，pH 7.2(NaOH调制)。0.5 1 h后，取 2片置入含0.1%胰 蛋白酶的2 mL人工脑脊液内消化0.5 h,消化过程中仍通混合气。将脑片稍加剪碎，移入2 mL 人工脑脊液内，用尖端火抛光的Pasteur吸管(直径500，300，150 m)顺续吹打，使组织块 分散，细胞游离。将此液静置

9、710 min，吸取上清液，滴加于事先涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，静置10 min使细胞贴壁，加入浴液即可开始膜片钳记录。分离过程在室温(2025) 下进行。采用膜片钳细胞贴附式结构记录通道电流3。实验用细胞浴液成分(mmolL -1):NaCl 140, CsCl 5， CaCl2 1.8， HEPES 10， TTX 0.001， 葡萄糖1 0，pH7.2；电极液成分(mmolL-1)；NMDA 20 molL-1；L-甘氨酸1molL-1，不含葡萄糖，其余同细胞浴液。“缺血”组细胞浴液成分除不含葡萄糖外 ，其余同正常浴液，在施加于细胞前通混合氮气(95%N25%CO2结果在电极液内加入20

10、 molL-1的NMDA和1 mol*L-1的L-甘氨酸以激动NMDA 受体，可记录到NMDA受体通道的单通道电流，其开放一般有两个电导水平，其电导值分别为 35 pS和100 pS，开放时电流幅度分别为(2.79±0.14) pA和(7.79±0.05) pA.开放概率 分别为(0.079±0.006) pS和(0.067±0.004)。 35 pS NMDA通道的开放时间需用双指数 拟合，其开放时间常数1和2分别为(0.56±0.10) ms和(4.17±0.38) ms, 10 0 pS NMDA通道的开放时间也需用双指数拟合，

11、其开放时间常数1和2分别为(0.50 ±0.38) ms和(7.80±1.74) ms.通道的关闭时间常数为(75.50±14.10) ms (n= 10)。 在“缺血”状态下，NMDA受体通道被显著激活，部分细胞膜片的通道开放为单个水平的开放 增加(1C)，部分细胞膜片的通道开放为多电导的开放(1D)，其电导水平以35 pS和100 p S为主。35 pS通道的开放时间常数1和2分别为(0.69±0.15) ms和(8.54±2. 46)ms.与对照组相比，2显著增加(P0.01)，通道的开放概率显著增加，达到0 .308±0.15

12、5(P0.01)；100 pS通道的开放时间常数1和2分别为(0.58 ±0.12) ms和(7.91±2.53)ms，与对照组相比，1和2均无显著差异，但通道的 开放概率明显增加，达到0.488±0.126(P0.01，n=7)。对于有多电导开放的 细胞，其总 的开放概率可达0.896±0.034，通道的关闭时间常数为(11.80±4.30) ms，显著缩短 于对照组(P0.01，n=9)。NMDA受体通道拮抗剂MK-801可显著抑制“缺血”诱导 的 通道开放(1E)。     Fig 1 Effect

13、s of “ischemia” on NMDA-receptor-channels in rat cereb ral cortical neurons recorded in the cell-attached configuration. Holding potent ial was set at-80 mV. Inward currents are indicated as downward deflections. A. 100 pS channels; B. 35 pS channels; C. 35 pS channels in “ischemia" condition.

14、D. 35 pS and 100 pS channels in “ischemia" condition; E. MK-801 0.05 mgmL-1 on NMD A-receptor channels in "ischemia" condition1“缺血”对大鼠大脑皮层神经元NMDA受体通道的影响讨论NMDA受体通道是存在于中枢神经系统内的一类受体门控通道，该通道对Ca2+ 有较大 的选择性，而对Na+和K+非选择性通透，对Cl?不通透，因此通道被激活后主要产生C a2内流48。本实验在玻璃微电极内加入20molL-1的 NMDA和1molL-1的L-甘氨酸

15、以激动NMDA受体，记录到正常的通道电活动，其开 放、关闭的动力学特征与文献报道基本一致，证明实验所记录到的通道是典型的NMDA受体通 道。该通道在开放时有多电导水平，本文仅分析35 pS和100 pS通道电流在“缺血”时的变 化特征。多数实验室均证明脑缺血时，脑细胞内Ca2浓度急剧增高，这是脑缺血损伤的 启动 因素之一。本实验用膜片钳技术直接观察到，在“缺血”状态下，大鼠大脑皮层神经元NMDA 受体通道被激活，35 pS电导水平通道开放时间常数较大的2显著延长，通道35 pS和1 00 pS电导水平的开放概率显著增加，关闭时间缩短，由于该通道对Ca2有选择性 通透，因此，NMDA受体通道的激

16、活可显著增加Ca2内流，对缺血时细胞内钙超载起 重要 作用。有些学者认为，脑缺血时，胞内Ca2的增多主要是通过NMDA受体通道，而膜 电压依赖性钙通道不起作用2，但我们用膜片钳技术直接观察到了在脑“缺血” 时L-和N-型电压依赖性钙通道的开放增加9。从本实验结果来看，大鼠皮层NMDA 受体通道在脑“缺血”时的开放程度比电压依赖性钙通道更显著，由此导致的Ca2 内流可能处于主导地位，电压依赖性钙通道的开放进一步加重了胞内钙的聚集，另外，在缺 血时，胞内钙释放也参与了钙的聚集10。* 第三军医大学科研基金资助作者单位：王中峰 中国科学院上海生理研究所7 信箱(上海200031)万子兵罗全生第三军医

17、大学生理学教研室(重庆400038)薛春生重庆医科大学药理学教研室参考文献1Salinska E, Pluta R, Puka M, et al. Blockade of N-methyl-D- aspartate-sensitive excitatory amino acid receptors with 2-amino-5-phosphovalera te reduces ischemia-evoked calcium redistribution in rabbit hippocampus. Exp Neu rol, 1991, 112:89.2Xie YX, Zacharias E,

18、Hoff P, et al. Ion channel involvement in anoxic depolarization induced by cardiac arrest in rat brain. J Cereb Blood Fluid Metab , 1995, 15:587.3Hamill OP, Marty A, Neher E, et al. Improved patch-clamp techniques fo r high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. P flugers Arch, 1981, 391:85.4Gibb AJ, Colquhoun D. Glutamate activation of a single NMDA receptor-c hannel produces a cluster of channel openings. Proc R Soc LondBiol, 1991, 243:39.5Gibb AJ, Colquhoun D. Activation of N-methyl-D-aspartate receptors by L-glutamate in cells dissociated from a